【显微课堂】冷冻电子断层扫描

样本的大小以及适用的观察技术。

该技术涉及样本的制备，样本在电子显微镜载网上，然后迅速陷入液氮中冷冻，使样本玻璃化，防止冰晶形成。

为了进行高分辨率的冷冻断层扫描，成像的标本切片厚度不应大于300纳米。为了观察样本的“较厚”部分（如细胞体），必须将样本减薄。除了冷冻超薄切片技术外，使用专门或多模态的冷冻扫描电子显微镜进行聚焦离子束(FIB)研磨是一种首选方法。两个离子束窗口的定位应确保在感兴趣区域内形成厚度大约200纳米的薄冰片（薄片），以便进行冷冻电镜电子断层扫描。

现在可以用冷冻透射电子显微镜扫描制备的样本，然后必须进行数据重建过程，将二维图像重建为单一的三维模型。

Coral Cryo 3D冷冻电子断层扫描工作流程解决方案

LAS X Coral Cryo：基于插值的三维目标定位，在x和y方向对切片进行多层扫描(z-stack)。这些标记可在所有相关窗口中交互式移动。

冷冻光学显微镜可以在两个重要方面对CryoET工作流程做出积极贡献。

首先，光学显微镜有助于评估样本的质量。使用冷冻光学显微镜可以快速了解样本的冷冻质量和冰层厚度，以及样本的分布是否适合进一步处理。徕卡的冷冻解决方案可确保样本在这些步骤中保持安全和活性。

其次，在提高工作流程效率方面，冷冻光学显微镜的最大潜力是能够在启动时间和成本密集型的冷冻电镜制备工作之前，更加精准地定位感兴趣的结构。徕卡的冷冻光学显微镜解决方案能够将目标结构的图像和坐标输出到后续的电镜步骤，从而显著缩短电镜成像时间。

一个完整载网的焦面总览，有不同的模式来识别载网缺陷、对齐标志和目标分布。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室Mahamid团队的Ievgeniia Zagoriy提供。蓝色–Hoechst，细胞核；绿色–MitoTracker Green，线粒体；红色–Crimson荧光珠和Bodipy，脂滴。一个载网方格的边缘长度：90微米，比例尺宽度：35微米。完整载网直径：3毫米

莱茵衣藻，两种不同类型的鞭毛内转运蛋白IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。样本由德国德累斯顿马克斯-普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的Pigino实验室提供。

了解无缝衔接的冷冻电子断层扫描工作流程Coral Cryo如何使用共聚焦超分辨率更精准定位您感兴趣的结构。该工作流程可减少并优化工作流程的步骤，改善样本的装载和传送，因此可提高CryoET工作流程的效率。

顶部扫描电镜视图（左图）和聚焦离子束视图（右图）的超分辨率三维共聚焦叠加图像。叠加是使用荧光珠作为相关性标志来执行的。HeLa细胞标记如下：细胞核由Hoechst标记，蓝色；线粒体由MitoTracker Green标记，绿色；脂滴由Bodipy和Crimson荧光珠标记，红色）。比例尺：20微米。细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室Mahamid团队的Ievgeniia Zagoriy提供，扫描电镜/聚焦离子束图像由该团队的Herman Fung提供。

STELLARIS 5 Cryo 冷冻共聚焦光学显微镜