腺相关病毒载体（AAV）用于递送治疗性基因。它们由约 3.7 Mda 的蛋白质衣壳组成，包含最多约 5 千碱基的基因组。我们对AAV的几个关键质量属性（CQA）进行了评估，包括DNA和蛋白质组分。聚集是需要控制的CQA之一，因为AAV容易聚集，并且受冻融的影响很大。此外，另一个重要因素是空壳比的存在，它们被认为是杂质，会对治疗产品的疗效和安全性产生不利影响。因此，准确评估完整/空壳比对保证产品质量至关重要。
通常情况下，人们使用分析超速离心法来测定 AAV 的完整/空壳比。该技术具有可重现性，但需要大量样品，且在GMP环境下实施具有挑战性。另一种选择是尺寸排除色谱法与多角度光散射（SEC-MALS）相结合。SEC-MALS 具有几个优点，包括无需样品制备，从而显著提高了通量。此外，基因组和衣壳的摩尔质量信息，以及它们的颗粒浓度，都可以与完整/空壳比一起确定。在本应用中，我们强调了 Biozen dSEC-7 色谱柱除了能够可靠地从两种 AAV 血清型中分离单体和聚集体，还可以结合 SEC-MALS，准确测定样品中的衣壳和 DNA 摩尔质量、颗粒浓度以及完整 AAV 百分比。
色谱条件
色谱柱：Biozen 3 μm dSEC-7
规格：300 x 4.6 mm
货号：00H-4789-E0
流动相：20 mM 磷酸盐缓冲液 + 350 mM 氯化钾 pH 6.6
流速：0.35 mL/min (Isocratic)
进样量：25 μL
温度：25 ℃
LC 系统：Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System
检测器：MALS, RI, and UV @ 260 nm, 280 nm
AAV5 血清型的总摩尔质量，以及结合蛋白质和基因组在其中的占比，被确定为 4.69 MDa（图 1）。在 260 和 280 nm 波长下，测定蛋白质衣壳和 DNA 的消光系数。实验测定值与理论值接近，表明 AAV5 样品的组装是正确的（表 1）。根据这些值，计算出 AAV5 血清型样品的完整/空壳比为 0.94，表明分析样品的衣壳填充率为 94%。与 AAV5 样品中观察到的现象类似，AAV8 样品的聚集体和单体也能够被很好的分离（图 2）。经过评估和测定后，总摩尔质量以及结合蛋白质和 DNA 摩尔质量的占比，被确定为 4.53 MDa。测定了该样品的两个消光系数，实验值与理论值相当（表 2）。AAV8 样品的完整/空壳比为 0.82，表明该样品的衣壳填充率为 82%。
分析物 | 总分子量（MDa） | 衣壳分子量 （MDa） | 核酸分子量（MDa） | 总（粒子/mL） | 完整/空衣壳比 |
AAV5-Empty | 3.85 | 3.85 | - | 1.82E+13 | - |
AAV5-CMV-GFP | 4.69 | 3.75 | 0.95 | 1.38E+13 | 0.94 |
图 1. AAV5 空衣壳（上）和完整衣壳（下）的摩尔质量测定
表 1. AAV5 在 260 nm 和 280 nm 波长下的消光系数比较
波长 | 蛋白质消光系数 | DNA 消光系数 | ||
理论 | 实验 | 理论 | 实验 | |
260 nm | 1.30 | 1.26 | 24.00 | 23.51 |
280 nm | 2.10 | 2.15 | 14.60 | 14.08 |
分析物 | 总分子量（MDa） | 衣壳分子量（MDa） | 核酸分子量（MDa） | 总（粒子/mL） | 完整/空衣壳比 |
AAV8-Empty | 3.94 | 3.94 | - | 2.25E+13 | - |
AAV8-CMV-GFP | 4.53 | 3.72 | 0.81 | 9.69E+13 | 0.82 |
图 2. AAV8 空衣壳（上）和 AAV5 完整衣壳（下）的摩尔质量测定
表 2. AAV8 在 260 nm 和 280 nm 波长下的消光系数比较
波长 | 蛋白质消光系数 | DNA 消光系数 | ||
理论 | 实验 | 理论 | 实验 | |
260 nm | 1.30 | 1.38 | 24.00 | 25.62 |
280 nm | 2.10 | 2.14 | 14.60 | 14.51 |
推荐阅读
如何正确选择mAbs和AAV分析方案？解锁Biozen dSEC系列两大宝藏工具
最新成果丨Biozen dSEC-7助力IVT mRNA聚集体分析
合作故事｜访云舟生物首席技术官蒙伟能：让专业回归专业
飞诺美全新Biozen dSEC-7 SEC色谱柱隆重上市！专为AAV及生物大分子聚集体分析设计
新突破！HPLC分析mRNA聚集体新方法: 大孔径SEC
体积排阻色谱法分析Cas9 IVT mRNA聚集体
讲座回放丨量“体”而出，“聚”焦基因疗法研究进程——使用新型尺寸排阻颗粒克服
全部评论(0条)
相关产品推荐（★较多用户关注☆）
OCTOPUS 制备液相色谱仪
报价：面议 已咨询 2349次
BioGantry全自动移液工作站
报价：面议 已咨询 2391次
ELSD 蒸发光检测器
报价：面议 已咨询 1995次
RI 示差检测器
报价：面议 已咨询 1884次
ATS 系列自动进样器
报价：面议 已咨询 1643次
CHEETAH HP 系列高效液相制备色谱
报价：￥356000 已咨询 2080次
EOPC全自动食用油极性组分分离系统
报价：面议 已咨询 5889次
AcceleSep 石油组分快速分离系统
报价：面议 已咨询 2524次
你可能还想看
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布，观点仅代表作者本人，不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们立即通知作者，并马上删除。
②凡本网注明"来源：仪器网"的所有作品，版权均属于仪器网，转载时须经本网同意，并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱：hezou_yiqi
在线留言
热点文章
近期话题
相关产品
沪公网安备 31011502008050号
参与评论
登录后参与评论