深度解读| GB 5009.305-2025重磅发布，双酚A/F/S检测的破局之道

难点一：复杂食品基质的干扰

难点二：免疫亲和柱的性能控制与操作

难点三：痕量分析的实验室控制与污染

难点四：仪器的高灵敏度要求

1.标准溶液配制

1.1 标准储备液(100 mg/L):准确称取双酚A、双酚F 和双酚S标准品各10mg(精确至0.1mg),分别用甲醇溶解并定容至 100mL，混匀。将溶液转移至棕色玻璃试剂瓶中,-18℃下避光保存,有效期为12 个月。

1.2 标准中间液(1mg/L):准确吸取双酚A、双酚F和双酚S的标准储备液各 0.10 mL,分别置于10mL,容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃试剂瓶中,-18 ℃下避光保存,有效期为6个月。

1.3 标准混合使用液(双酚 A和双酚F:100 μg/L;双酚 S:10 μg/L):准确吸取双酚 A 和双酚F的标准中间液各 1.0mL、双酚S的标准中间液 0.10mL,置于10mL,容量瓶中,用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混匀。临用现配。

1.4 同位素内标中间液(1 mg/L):准确吸取¹³C12-双酚A标准溶液、¹³C12-双酚F标准溶液和¹³C12-双酚 S标准溶液各 0.10 mL,分别置于 10 mL,容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃试剂瓶中,-18℃下避光保存,有效期为6个月。

1.5 同位素内标混合使用液(¹³C12-双酚 A 和¹³C12-双酚F:100 μg/L;¹³C12-双酚 S:10 μg/L):准确吸取¹³C12-双酚 A 和¹³C12-双酚 F 中间液各 1.00 mL、¹³C12-双酚S中间液 0.10 mL,置于10mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混匀，临用现配。

1.6 标准系列工作液:分别准确吸取标准混合使用液 0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、0.80 mL.1.00 mL、2.00 ml, 于 10 ml,容量瓶中,加人 0.50 mL,同位素内标混合使用液,用甲醇-水溶液(40+60)定容至刻度,混匀。标准系列工作液中双酚A 和双酚F的质量浓度分别为1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、8.00 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L,双酚S的质量浓度分别为 0.100 μg/L、0.200 μg/L、0.500 μg/L、0.80μg/L、1.00μg/L、2.00 μg/L,¹³C12-双酚 A和¹³C12-双酚F的质量浓度为5.00μg/L,¹³C12-双酚S的质量浓度为 0.500 μg/L。临用现配。

2.前处理

2.1试样提取

2.1.1 肉及肉制品、水产品、固态及半固态乳制品(乳粉、发酵乳等)、婴幼儿配方食品

称取1g试样(精确至 0.01 g),置于50mL聚丙烯离心管中,加入50 μL同位素内标混合使用液,振荡混合后静置 30 min。加入2mL水,涡旋振荡30s,再加入5mL乙腈涡旋混合。混合液超声提取15 min,4 ℃下 10000 r/min 离心 10min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮气缓缓吹至约2mL,加入8 mLPBS混匀,待净化。

2.2.2 蛋、乳及液态乳制品

称取1g试样(精确至 0.01g),置于50 mL,聚丙烯离心管中,加入50 μL同位素内标混合使用液,振荡混合后静置 30 min。加入5 mL乙腈,涡旋混合后超声提取 15 min,4 ℃下 10 000 r/min 离心10 min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮气缓缓吹至约2mL,加入8 mLPBS混匀,待净化。

2.2.3 谷物及婴幼儿谷类辅助食品

称取1g试样(精确至 0.01g),置于50 mL聚丙烯离心管中,加入50 μL 同位素内标混合使用液,振荡混合后静置 30 min。加入10mL甲醇-水溶液(80+20),涡旋振荡 30s,超声提取 15min,4 ℃下10000 r/min 离心 10 min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氨气缓缓吹至约2mL,加入8 mLPBS混匀,待净化。

2.2.4  蔬菜、水果

称取1g试样(精确至 0.01 g),置于50 mL,聚丙烯离心管中,加入100 μL 盐酸溶(10+90)混匀，再加入50 μL,同位素内标混合使用液,振荡混合后静置 30min。加入5mL乙腈,涡旋振荡 30s,超声提取15min,4 ℃下 10000 r/min 离心10min。取上清液置于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮气缓缓吹至约2mL,加入8 mLPBS混匀,待净化。

2.2.5饮料

称取1g试样(精确至 0.01 g),置于2mL,聚丙烯离心管中,加入50 μL同位素内标混合使用液,振荡混合后静置 30min。10000 r/min 离心10min。取上清液至50 mL聚丙烯离心管中,加入10mLPBS 混匀,待净化。

注:澄清试样(如纯净水、矿泉水等)可不离心,直接加人PBS混匀。

3.净化

将低温下保存的双酚A/F/S复合免疫亲和柱（PN:AN70A036),恢复至室温,然后让柱内原有液体自然流尽。取1.2中试样提取液全部过柱,自然流干,弃去全部流出液,再用10mL,水淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干免疫亲和柱。加入1mL甲醇洗脱,收集洗脱液于玻璃氮吹管中,40 ℃下用氮气缓缓吹干。准确加入0.40mL,甲醇,涡旋混合10s,再准确加入0.60mL水,涡旋混合后转移至2mL聚丙烯离心管中,10000 r/min下离心5min,取上清液供液相色谱-串联质谱仪测定。

4.仪器条件

4.1液相色谱条件

（1）色谱柱:Leosil XP杂化硅胶UPLC C18柱,100 mmx2.1 mm,1.7 μm（PN:AN80A006 ）或相当者

（2）流动相:A相为水,B相为甲醇。流动相梯度条件见表1。

（3）流速:0.3 mL/min。

（4）柱温:40 ℃。

（5）进样量:5 μL。

表1 流动相梯度条件

4.2 质谱条件

（1）电离方式:电喷雾电离,负离子模式。

（2）扫描方式:多反应监测(MRM)。

（3）毛细管电压:2.0 kV。

（4）离子源温度:150 ℃。

（5）脱溶剂气温度:450 ℃。

（6）脱溶剂气流量:900 L/h。

表2  定性离子对、定量离子对以及锥孔电压和碰撞能量

准确吸取双酚 A、双酚F 和双酚S的标准中间液各 625 μL,置于同一25mL容量瓶中,用 PBS 定容至刻度,充分混匀后用于免疫亲和柱上样。分别取同一批次3根免疫亲和柱,每根柱的上样量为8 mL。按净化步骤进行上样,淋洗和洗脱,收集洗脱液,用初始流动相稀释定容至 10mL,上液相色谱-串联质谱仪测定。用 20.0 μg/L,的溶剂标准工作溶液做单点校准计算上机试样中双酚 A、双酚F 和双酚S的含量。

结果判定:上机试样中双酚 A、双酚F和双酚S的含量均>18.0μg/L（即回收≥90%）可使用商品。