1、适用范围

本文件适用于面米制品、乳及乳制品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定，也适用于食物中毒呕吐物中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定。 

2、标准品

蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C57H96N6O18，CAS 号：157232-64-9），浓度为 25μg/500μL 或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

13C6-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C5113C6H96N6O18，CAS号1487375-69-8），浓度为 20 μg/mL或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3、标准溶液配制

3.1、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准中间液（1.0 mg/L）：准确吸取标准溶液0.200 mL 置于10.0 mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至 10.0 mL，浓度为 1.0 mg/L 的标准中间液，于-18 ℃冷冻保存，有效期 3 个月。

3.2、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准中间液（1.0 mg/L）：准确吸取标准溶液0.500mL，置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至 10.0 mL，浓度为 1.0 mg/L 的标准中间液，于-18 ℃冷 冻保存，有效期3个月。

3.3、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准工作液（0. 1 mg/L）：准确吸取标准中间液1.0 mL（1.0 mg/L）置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成 0. 1 mg/L 的标准工作液，— 18 ℃冷冻保存，有效期1个月。

3.4、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准工作液（0. 1 mg/L）：准确吸取内标标准中间溶液1.0 mL，置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成 0. 1 mg/L 的内标标准工作液，于-18 ℃冷冻保存， 有效期1个月。

3.5、标准系列工作溶液：准确吸取 0. 1 mg/L 的标准工作液，10 μL 、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1000 μL 分别置于 10.0 mL 容量瓶中，加入 200 μL 0. 1 mg/L 的内标标准工作液，用初始流动相制成浓度分别为 0. 1 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L 的标准系列溶液，含内标浓度为 2.0μg/L，现用现配。

4、食品试样提取

称取1 g（精确至0.01 g）均质后的食品样品置于15 mL离心管，加入内标标准工作液（1 mg/L）20 μL，静置30 min后，准确加入5.0 mL乙腈，涡旋混均30 s，超声30 min。4 ℃下12 000 r/min离心10 min 。转移全部上清液至15 mL离心管中，加入5.0 mL水，涡旋混合30 s ，待HLB-P（AN60F098）柱净化。

5、样品净化

(1) 食品试样净化

HLB-P柱经3.0 mL甲醇，3.0 mL纯水依次活化，取食品样品提取液上样（如果上柱溶液粘度较大，过滤较为缓慢，可以1.2 mL/min 速度抽滤过柱），待上样液完全过柱后，以3.0 mL纯水淋洗小柱，5.0 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气浓缩至近干，残渣用1.0 mL初始流动相复溶，过微孔滤膜供上机测定。

(2) 食物中毒呕吐物样品净化

吸取食物中毒呕吐物样品提取液5.0 mL，直接上HMR（AN60F245）脂质增强去除小柱净化，弃去前0.5 mL过柱液后收集2.0 mL过柱溶液，过膜供上机测定。

6、超高效液相色谱-串联质谱仪器参考条件

a) 色谱柱：Leosil Gold Protein C18 300?, for Cereulide, 3μm, 100 x 2.1 mm（AN80A364）。

b)流动相：流动相A相为0. 1%甲酸乙腈溶液，B相为0. 1%甲酸-2.0 mmol/L乙酸铵水溶液。

c) 流速：0.35 mL/min

d)柱温：40 ℃

e)进样量：5 μL

梯度洗脱程序见表

质谱条件：