用户文章 |《The ISME Journal》中国科学院广州地球化学研究所罗春玲、李继兵团队基于单细胞技术揭示土壤真菌原位降解新机制

2025年11月25日，中国科学院广州地球化学研究所团队在环境微生物学顶级期刊《The ISME Journal》上发表了题为：

“In situ degradation of 2-methylnaphthalene by a soil Penicillium strain associated with fungal-bacterial interactions”的研究论文。该研究首次结合单细胞拉曼激活细胞分选（RACS）与稳定同位素探测（SIP）技术，成功从石油污染土壤中直接识别、分选并鉴定出一株能够原位高效降解新型有机污染物（2-甲基萘）的青霉菌新菌株Penicillium sp. LJD-20，并揭示了其独特的降解基因谱与潜在的真菌-细菌互作机制。

长光辰英核心产品——PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪为研究提供了关键的单细胞识别与分选平台，通过精准捕获代谢活性细胞，并结合基因组学分析，为深入解析真菌在环境污染修复中的功能与生态角色提供了强有力的技术支撑。

本研究旨在原位识别并表征能够降解2-甲基萘的活性真菌，并阐明其降解机制。

1.样品：采集胜利油田石油污染土壤，设置添加13C标记或未标记2-甲基萘的微环境体系，并添加抗生素抑制细菌活性，以聚焦于真菌的贡献。

2.单细胞拉曼识别与分选（RACS）：单根真菌菌丝进行拉曼光谱采集。通过识别由13C掺入导致的特征峰位移（如蛋白质Amide III峰从1105 cm?1偏移至1082 cm?1），精准定位正在代谢污染物的活性真菌细胞。

3.活性细胞分选与测序：利用激光诱导向前转移技术，将具有13C标记信号的单根活性真菌菌丝分选至收集管中，进行单细胞基因组扩增与测序。

4.DNA稳定同位素探测验证：对土壤总DNA进行密度梯度离心，分离轻重组分，通过测序验证活性真菌在重DNA组分中的富集，并与RACS结果相互印证。

5.菌株培养与功能验证：将分选得到的活性真菌单细胞进行培养，获得纯培养菌株LJD-20，评估其在不同条件下的生长及对2-甲基萘的降解能力，并测定相关胞外酶活性。

6.基因组与代谢途径分析：对单细胞基因组进行测序和功能注释，鉴定与污染物降解相关的基因，并结合LC-MS/MS检测的代谢中间产物，推测其可能的降解途径。

1.基于¹³C位移的活性甲基萘降解微生物单细胞拉曼光谱分析

研究团队利用单细胞拉曼光谱结合稳定同位素标记技术，成功识别出在污染土壤中原位降解2-甲基萘的活性真菌细胞。实验中使用13C标记的2-甲基萘作为底物。活性降解菌在代谢过程中会将13C同位素同化到自身生物分子中，导致其拉曼光谱发生特征性位移。在150根菌丝中，10根菌丝的拉曼光谱显示出明显的13C特征位移，这些位移在对照组的菌丝中完全不存在。在未标记的细胞中，Amide III蛋白谱带位于约1105 cm?1。而在来自13C标记体系的活性降解细胞中，该谱带明显位移至1082 cm?1。

2.基于 DNA 稳定同位素探针技术对原位活性甲基萘降解微生物的鉴定与验证

通过拉曼光谱识别出的10根活性真菌菌丝，利用拉曼激活细胞分选（RACS） 技术进行精确分选。分选后的单细胞进行多重置换扩增（MDA），获取足够量的DNA用于测序。进行ITS基因测序以鉴定物种，并进行单细胞基因组测序以分析功能基因。ITS测序结果显示，该活性真菌属于青霉菌属（Penicillium）。其ITS序列与已知菌株 Penicillium paxilli 的相似度为96.7%，低于界定物种的阈值（98.6%），因此被认定为一个未被报道过的新物种，命名为 Penicillium sp. LJD-20。在实验体系中添加了抗生素以抑制细菌，SIP结果进一步证实：所有细菌类群的REF值均< 1.5，表明在本实验条件下，细菌未直接参与2-甲基萘的降解，降解过程主要由真菌驱动。

该部分研究成功地将单细胞分选技术与群落水平同位素示踪技术有机结合，不仅鉴定出一株新的活性降解真菌 Penicillium sp. LJD-20，更通过多重技术相互印证，构建了一个严谨、可靠的环境功能微生物鉴定与验证范式，为复杂环境中微生物原位功能的解析提供了方法学典范。

图2.利用拉曼激活细胞分选技术对功能性真菌细胞进行分离与系统发育分析

3.多视野成像的细胞计数及通过 D?O 探针评估酵母的代谢活性

为阐明通过RACS鉴定出的活性真菌降解菌对2-甲基萘的生物降解和生物强化机制，通过单细胞基因组测序并结合KEGG数据库注释，分析了其功能基因和潜在的代谢途径。除了检测到真菌中常见的细胞色素P450酶编码基因（外，我们还鉴定出通常与细菌相关的、对芳香化合物降解至关重要的双加氧酶基因。这些基因包括编码环羟基化双加氧酶（RHD）、芳香环开环双加氧酶（AROD）以及醛脱氢酶（mIdD）的基因，其中mIdD是在甲基萘代谢过程中将2-萘甲醛转化为2-萘甲酸的关键酶。

功能注释和序列同源性表明，鉴定出的基因很可能来源于真菌。这些鉴定出的双加氧酶此前未经过表征，但与已报道的蛋白质显示出相对较强的氨基酸序列相似性。例如，RHD与来自青霉菌和曲霉的蛋白质分别具有78.3%和78.1%的序列相似性；AROD与来自不同青霉菌菌株的蛋白质分别具有76.7%、76.2%和73.6%的序列相似性。鉴定出的P450酶与先前表征的蛋白质氨基酸序列相似性低于83.4%，表明它们是已知P450家族中的分化同源物。

同样，本研究观察到的mIdD与其最相近的已知同源物序列相似性也低于80%。这些发现表明，降解甲基萘的菌株LJD-20拥有与有机污染物去除相关的基因所编码的功能蛋白。

图3.分离微生物的代谢潜力及其胞外酶分析

4.建立与验证 CNN 模型用于酵母分类

通过LC-MS/MS分析，在LJD-20降解2-甲基萘的过程中，稳定检测到两种主要中间代谢物为2-萘甲醇和2-萘甲醛，这两种代谢物的出现，强烈提示存在一条以甲基末端氧化为主导的降解途径。单细胞基因组分析进一步支持了这一代谢推断，发现了一个类似 nidD 的基因，编码醛脱氢酶。该酶很可能负责将2-萘甲醛进一步氧化为2-萘甲酸，从而在侧链氧化过程中发挥关键作用。结合此前鉴定到的双加氧酶基因，研究推测LJD-20可能具备双途径降解潜力：甲基末端氧化途径（经2-萘甲醇、2-萘甲醛）和芳香环氧化裂解途径（依赖双加氧酶）。

本研究通过“代谢物-基因”双维度证据链，首次系统推测了青霉菌LJD-20降解2-甲基萘的双途径代谢蓝图。这不仅在生化机制上深化了对真菌降解烷基化PAHs过程的理解，更重要的是从生态适应视角诠释了真菌降解基因分布的进化意义。

本研究通过创新性地整合单细胞RACS-SIP技术与基因组学分析，建立了一套从复杂环境中直接“捕捞”并解析活性功能微生物的完整方法学体系。成功发现并证实了一株具有多重降解潜力的青霉菌新菌株LJD-20是2-甲基萘的原位降解者，并首次在单细胞水平上揭示了其与伴生细菌潜在的代谢互作蓝图。

该研究突破了传统真菌生物修复研究的瓶颈，极大地拓展了对真菌代谢多样性及其在环境污染修复中关键生态角色的认知，为开发基于真菌群落调控的新型生物修复策略提供了重要的理论与技术基础。

罗春玲

博士，研究员。2006年，于香港理工大学获博士学位。学科方向为环境有机地球化学。近期研究主要集中在有机污染物在土壤-植物系统的迁移转化、土壤生物修复、污泥资源化利用。研究成果发表SCI刊物论文150余篇，论文被SCI引用5000余次，参与编写论著3部，授权发明专利10余项。现任中国土壤学会土壤环境专业委员会委员、中国土壤学会国际合作专业委员会委员、中国环境科学学会新污染物治理专业委员会委员、广东省可持续发展协会理事。曾入选中国科学院国外杰出人才引进计划“百人计划”（2010）、中组部“万人计划”青年拔尖人才（2017）、获国家优秀青年基金（2014）资助。

李继兵

中国科学院广州地球化学研究所副研究员，硕士生导师。2018年于中国科学院大学获博士学位。曾获广东省杰出青年基金、广州市科技菁英“领航”计划。入选中国科学院广州分院年度优秀青年科技工作者、“中国科学院青年创新促进会”会员、“广东省100位博士博士后创新人物”和“国家博士后创新人才支持计划”，获得中国科学院优秀博士学位论文和中国科学院院长优秀奖等。主要从事环境微生物技术和土壤有机污染，尤其是发展和利用稳定同位素示踪（SIP）-单细胞拉曼分选和分子生物学联用技术，开展多环芳烃/石油烃及其衍生物等有机污染物的生物降解研究。相关成果发表SCI论文50余篇，第一/通讯作者SCI论文31篇，包括ISME J、Environmental Science & Technology、Water Research、Soil Biology and Biochemistry、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等国际权威期刊论文，授权国内国际发明专利15件。现任国际期刊《Resources, Environment and Sustainability》及《地球化学》青年编委。

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