通过整合无细胞蛋白合成体系与固相支持膜耦合的微电生理检测技术，实现转运蛋白功能的连续、原位表征

研究背景与目的

转运蛋白研究的重要性与挑战：转运蛋白负责跨细胞膜运输多种物质，与人类疾病、药物吸收分泌、耐药性及工业生物技术等密切相关。但由于缺乏直接实验检测方法，其功能表征存在高成本和技术挑战，传统方法如经典摄取测定、质谱、生物传感器等存在易受细胞背景干扰、需标记底物或耗时等问题。其中质谱分析虽具备高灵敏度和高分辨率的优势，可分析复杂样品混合物，但该方法需要样品预处理和高成本的仪器设备，这也进一步加剧了转运蛋白功能表征的成本压力。

SSME技术的优势：SSME能够直接进行无标记、实时测量，适用于无细胞样品且具备高通量筛选能力——高通量筛选技术集计算机控制、自动化操作、高灵敏度检测、数据结果自动采集和处理于一体，可实现快速、微量、灵敏和大规模筛选，日筛选量可达数万甚至数十万样品次，SSME通过检测电荷易位产生的瞬态电流来反映转运过程，但前提是要有稳健的功能转运蛋白生产方案。

研究目的：为解决转运蛋白纯化难题，将连续交换无细胞合成（CECF）系统与SSME结合，开发一种新的功能表征工作流程，实现转运蛋白的高效表达与活性检测。

无细胞合成 (CFPS) 的前端制备优势

CFPS技术绕过了传统的细胞培养和蛋白纯化步骤，特别适合制备转运蛋白这类对细胞有潜在毒性或难以正确折叠的膜蛋白。其优势包括：

·快速高效：从DNA模板到获得可检测的蛋白质，通常在几小时内即可完成。

·避免毒性：完全在体外进行，解决了表达毒性蛋白的问题。

·直接整合：合成后的蛋白可以直接用于功能检测，无需繁琐的纯化。

材料与方法

材料与质粒构建：实验所用大肠杆菌S30提取物与T7 RNA聚合酶，以及脂质、膜支架蛋白（MSP1E3D1）、去污剂等试剂，均购自对应专业供应商。将五种转运蛋白（EmrE、SugE、LacY、NhaA、AAC2）的基因克隆到不同表达载体，部分引入标签或突变。

无细胞合成与蛋白纯化：采用连续交换无细胞合成反应，在含1% DDM或50μm预组装纳米圆盘（NDs）条件下进行。分析规模反应使用双室迷你容器，制备规模使用透析盒与反应室（chamber）。反应混合物含40%大肠杆菌A19 S30提取物、RNasin、质粒、T7-RNA聚合酶等，30°C孵育18小时。通过离心去除沉淀，上清用于分析或纯化。SugE因沉淀需特殊处理，可参考降低离心力至原来的20-50%、改用截留分子量更大的超滤膜等方式优化处理；其他Strep-tagged转运蛋白采用亲和层析法，用Strep-Tactin?XT sepharoseTM纯化，EmrE采用金属螯合亲和层析法，用Ni-NTA琼脂糖纯化，纯化蛋白浓缩至2mg/mL以上（建议不超过20mg/mL）并经SDS-PAGE（变性条件下根据蛋白质亚基大小分离的电泳检测方法）检测。

蛋白脂质体重构：将纯化的大肠杆菌转运蛋白重构到含大肠杆菌极性脂质（EPL）的脂质体中，AAC2则用酵母极性脂质（YPL）加5%心磷脂（CL）。将脂质溶解后经旋转蒸发成膜，水化后依次进行超声处理与挤出操作。ND复合物用DDM裂解，与溶解有去污剂的脂质体按一定脂质－蛋白比例混合，通过Biobeads去除去污剂，重构样品分装冻存。

基于固体支持膜的电生理学检测：使用SURFE2R N1仪器，金涂层传感器经十八硫醇处理，涂覆磷脂后加载样品。采用单溶液交换或双溶液交换协议，记录不同底物和pH条件下的电流，传感器电容15-45nF、电导<10nS用于后续实验。

数据分析与计算：用SURFE2R N1 Control软件分析峰值电流，至少3个传感器重复。用Michaelis-Menten方程（I = Vmaxc / (K0.5 + c)）计算半饱和常数K0.5（当无PSS电流时等于KM）。

结果与讨论

无细胞转运蛋白表达与蛋白脂质体重构：在NDs存在的连续交换无细胞表达系统中合成转运蛋白，通过GFP荧光确定DOPG脂质的NDs对EmrE和AAC2 incorporation效率最高，合成量约为0.47±0.04 mg/mL（AAC2）和0.6±0.04 mg/mL（EmrE）。SDS-PAGE分析显示各转运蛋白存在单体及寡聚体，提示NDs中可能形成功能复合物，SugE溶解度差需特殊处理。

EmrE中H+/TPA+交换的pH影响：以TPA+为底物，EmrE重构到EPL蛋白脂质体中，在pH7.5对称条件下，4mM TPA+引发约-1.7±0.06nA的负峰值电流，符合1 TPA+对2H+的转运化学计量。NDs合成的EmrE电流显著高于1% DDM合成的样品。pH依赖性实验显示最大转运速率在pH7.4，pH6.5时KM为2.8±1.1 mM，中性pH为0.85±0.18 mM，碱性pH为0.27±0.08 mM，表明TPA+和H+竞争结合位点。

图 1. 利用四丙基铵（TPA +）作为底物通过单分子膜电泳（SSME）对 EmrE 进行表征。

（a）EmrE 的转运模式图示及 TPA + 的化学结构。

（b）在 pH 7.4 时由 4 mM TPA + 浓度突变触发的 EmrE 的瞬态电流，EmrE 由纳米盘（NDs）（粉色）或十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（青色）重新构建，以及由空的大肠杆菌极性脂质（EPL）脂质体（黑色）组成的阴性对照。

（c）在 NDs 或 1% DDM 存在下产生的 EmrE 的平均峰值电流；数据集代表 3 个单独传感器在 4 mM TPA + 时正电流的最大振幅。误差线表示标准偏差。**** 表示 p < 0.0001，n = 3。

（d）在 7 个不同 pH 值（5.5、6.5、7、7.4、8、8.5 和 9.5）下由 1 mM TPA + 浓度突变触发的 3 个单独传感器的 EmrE 记录的归一化峰值电流。误差线表示标准偏差。

（e）由不同浓度的 TPA + 触发的 EmrE 的瞬态电流，如不同颜色所示。所有描绘的轨迹均在同一传感器上记录。

（f）在 3 种不同 pH 条件（6.5、7.5 和 8.5）下的底物依赖性电流幅度。数据点代表来自 5 个不同传感器的平均和归一化值。每个传感器的数据集首先归一化到其 IMAX 值，然后在 5 个传感器之间取平均值，绘制并拟合到米氏方程（实线）。误差棒表示标准偏差。表 1 中报告了表观 KM 值。

SugE中天然底物衍生物结合诱导的预稳态电流：SugE经处理后保留功能，Gdm+浓度梯度引发约-4.6±0.6nA负峰值电流，符合2:1的H+:Gdm+转运化学计量，KM为2.0±0.3 mM。Gdm+衍生物引发快速正峰电流，为底物结合后的预稳态事件，如构象转变，通过Michaelis-Menten方程得到不同衍生物的KM值。

图2. 以胍基离子（Gdm+）为底物时SugE的 SSME 表征。

(a)SugE转运模式的图形表示及Gdm+的化学结构。

(b)在pH 7.4条件下，由4 mM Gdm+浓度突变触发的SugE从CF颗粒中复性后的瞬态电流（红色）与由空 EPL 脂质体组成的阴性对照（黑色）。

(c)在pH 7.4条件下，不同Gdm+浓度触发的SugE瞬态电流（用不同颜色标示）。所有可视化轨迹均记录于同一传感器上。

(d)pH 7.4条件下Gdm+依赖性电流振幅。数据点代表来自3个不同传感器的平均化归一化值。各传感器数据集首先归一化至其IMAX值，随后在3个传感器间取平均值绘制曲线，并拟合米氏方程（实线）。误差线表示标准偏差。表1报告了表观KM值。

H+偶联糖转运蛋白LacY的电生转运：LacY在pH7.4时30mM乳糖引发约1.6±0.07nA正峰值电流，100mM melibiose和lactulose引发电流振幅分别为乳糖的61%和35%。乳糖、乳果糖、蜜二糖的KM值分别为1.3±0.3 mM、0.98±0.14 mM、4.7±0.8 mM，与体内摄取实验相比，SSME的KM值对应易化扩散实验结果。pH影响实验显示酸性条件下电流振幅下降且衰减快，碱性条件下电流大且衰减慢。

图3. 基于固态膜电位检测技术（SSME）对LacY转运蛋白在乳糖、乳果糖及棉子糖存在下的功能表征。  

（a）实验条件下LacY的质子偶联底物转运机制示意图；右侧附乳糖的化学结构式。  

（b）pH 7.5条件下，LacY重构脂质体（粉色曲线）与空白大肠杆菌极性脂质（EPL）脂质体对照组（黑色曲线）的瞬态电流响应；转运活性通过30 mM乳糖浓度阶跃激发。  

（c）pH 7.4条件下，100 mM乳糖（蓝色）、棉子糖（橙色）或乳果糖（绿色）浓度阶跃诱导的LacY瞬态电流响应；所有电流曲线均在同一SSME传感器上同步采集，并统一归一化至各自底物对应的最大峰值电流（I_max）。  

（d）pH 7.4时LacY对不同糖类的剂量依赖性电流响应幅度。数据点表示三个独立传感器重复实验的归一化平均值（n = 3）；误差棒代表标准偏差（SD）。各传感器原始数据均先归一化至其自身I_max，再进行跨传感器平均；实线为米氏动力学模型拟合结果；表1列出了拟合所得的表观K_M值。  

（e）pH 7.4时，不同浓度乳糖（0–30 mM）阶跃激发的LacY脂质体代表性瞬态电流曲线；颜色编码对应乳糖浓度；所有曲线源自同一传感器，并归一化至30 mM乳糖所对应的I_max。  

（f）固定30 mM乳糖浓度阶跃下，不同pH条件（6.8–8.0）对LacY电流响应的影响；颜色标识pH值；所有曲线源自同一传感器，并归一化至pH 8.0条件下的I_max。  

使用热稳定突变体优化功能性NhaA合成：野生型NhaA在pH8.5、300mM Na+时电流约-0.27±0.04nA，热稳定tsNhaA（A109T、Q277G、L296M突变）电流约-0.50±0.07nA，为野生型的2倍，KM为16.0±2.8 mM，与之前SSME结果一致，但高于摄取实验的KM值。

图4. 天然态与热稳定化NhaA的表征。

(a) 实验条件下大肠杆菌Na+/2H+反向转运蛋白(NhaA)转运模式的图形表示。

(b) NhaA野生型（粉色）、tsNhaA（青绿色）及由空载大肠杆菌极性脂质(EPL)脂质体构成的阴性对照的瞬态电流，转运体在pH 8.5条件下通过300 mM浓度跃变触发。

(c) NhaA野生型与tsNhaA在300 mM氯化钠条件下的平均峰值电流记录。

(d) pH 8.5时钠依赖性电流振幅，数据点代表来自三个不同传感器的平均归一化值。各传感器数据集首先归一化至其IMAX值，随后对三个传感器数据进行平均处理、绘图并拟合米氏方程（实线）。表1报告了表观KM值。

ATP/ADP交换体AAC2的转运和预稳态电流：AAC2重构到含YPL和5% CL的脂质体中，双溶液交换协议下，预加载反底物时，300μM ATP4-或ADP3-引发约±0.5nA峰值电流，符合ADP influx/ATP efflux的电荷变化。无反底物时，ATP4-或ADP3-引发小峰值电流，代表半转运周期，ATP的K0.5为40±20 μM，与其他物种和制备方法存在差异。

图5 酵母线粒体腺苷酸转运蛋白AAC2的功能表征。

（a）在pH 6.2条件下，由300 μM ADP3?诱导的AAC2瞬态电流响应。脂质体预先装载300 μM ATP??作为反向底物（黑色曲线），或未装载任何反向底物（红色曲线）。

（b）反向实验设置下的AAC2瞬态电流：由300 μM ATP??诱导，脂质体分别未装载反向底物（紫色曲线）或预装载300 μM ADP3?（青色曲线）。

（c）AAC2在预稳态（pre-steady-state, PSS）及反向转运模式下的示意图。AAC2以蓝色圆角矩形表示；箭头指示底物与反向底物的跨膜转运方向；蛋白旁标注的数值代表每次转运事件所伴随的净电荷转移量。

（d）在pH 6.2、无反向底物预装载条件下，ATP??浓度依赖性电流幅值。数据点为三个独立传感器测量结果的平均值（经归一化处理）：各传感器原始电流数据首先归一化至其自身最大响应值（I???），随后对三组归一化数据取均值并绘图；实线为双曲线拟合结果，据此获得半饱和浓度K?.?

研究应用与前沿进展

目前，该技术组合主要应用于基础研究和药物发现领域：

·功能筛选与鉴定：成功用于鉴定未知功能的细菌转运蛋白，例如从宏基因组中发现的孤儿转运蛋白（orphan transporter）。

·药物筛选与安全性评估：利用人源转运蛋白进行高通量药物筛选，评估化合物对特定转运蛋白（如多药耐药相关蛋白（MRP1））的抑制或激活效应，并用于早期药物毒性评估。

·突变体功能分析：快速表征疾病相关的转运蛋白突变体，通过对比野生型和突变型蛋白的电生理活性，揭示突变对功能的分子机制影响。

·前沿研究也在不断发展：

·自动化平台：部分实验室已建立机器人平台，实现“合成-检测”流程的完全自动化，显著提升了通量。

·多蛋白复合体：CFPS正被用于共表达转运蛋白及其调控亚基，SSME则用于研究复合体的功能，这对理解生理调节至关重要。

·新型膜系统：SSME技术本身也在演进，如结合纳米圆盘（nanodiscs）等技术，为转运蛋白提供更仿生的膜环境。

总体结论

本研究成功开发了一种结合无细胞蛋白质合成与SSME的新型工作流程，可在约五天内对转运蛋白进行功能表征。通过对五种不同转运蛋白（EmrE、SugE、LacY、NhaA、AAC2）的验证，能够确定其底物特异性、动力学参数（如KM、IMAX）和pH依赖性，并获得转运蛋白功能的机制见解。该工作流程为转运蛋白在医学和生物技术研究中的应用提供了便捷的直接功能评估方法。转运蛋白研究是国际备受关注的研究课题，自2006年被美国、欧盟和日本等发达国家医药管理部门认可，并收入相关指导原则，广泛应用于创新药物的早期筛选和临床药物相互作用评价研究，同时还可作为疾病药物的靶点，比如在高尿酸血症治疗中，尿酸转运体URAT1、GLUT9等是关键作用靶点，足见其具有重要的研究价值和广阔的应用前景。