案例分享-用SURFE2R N1代替放射性标记技术

基于SURFE2R技术的固相支撑膜（Solid-Supported Membrane, SSM）电生理检测方法研究：原理、优势与应用局限性分析

研究背景与目的

• 研究方向
  兰迪·斯托克布里奇博士实验室专注于发现和理解膜转运蛋白，包括通道和能量耦合泵，这些蛋白是细胞的分子守门人，对微生物在恶劣环境中的生存至关重要，其研究有助于开发新的抗菌药物。
• 研究对象
  团队已发现氟化物（F-）和胍盐（Gdm+）两种有毒离子的 exporters，氟化物通道保护细菌免受环境氟离子毒害，胍盐离子 exporters 与抗生素耐药性相关的多药 exporters 有有趣的进化关系。
• 研究问题
  围绕这些转运蛋白提出四个关键问题，即它们的结构、工作原理、进化过程以及生物学作用。
• 技术需求
  团队最初使用放射性标记底物摄取法对新转运蛋白家族进行初步表征，但需要更通用的检测方法以扩展到非商业放射性标记底物，且荧光法不适用，平面脂质双分子层电生理技术无法检测其产生的小电流，因此寻求高灵敏度的检测设备。

SURFE2R N1平台的应用

• 平台优势
  Nanion的SURFE2R N1平台可高灵敏度研究电致膜转运蛋白，已研究超过100个目标，包括协同转运蛋白、交换蛋白、单向转运蛋白、离子泵和离子通道。其特点包括无标记直接测量、实时即时响应、电容读出、通过离子载体进行电压控制、传感器稳定性高、可进行多小时多次测量、成功率和重现性高、自动化程度高（使用多达53种溶液进行自动测量，SURFE2R N1每天可达150个数据点，SURFE2R 96SE每天可达10,000个数据点）、可进行底物和抑制剂测定（对疏水性化合物和金属离子，阴性对照至关重要）、目标范围广、样品灵活性高（原生膜或蛋白脂质体，每个传感器样品消耗低至<0.1 μg蛋白，可能需要高蛋白密度）以及高灵敏度（巨大的传感器表面，可检测低至0.1 s?1的转运速率，甚至构象转变和结合）。
  
  
  
• 项目实施
  团队希望表征新转运蛋白家族的电生理特性，以确定底物的Km和Vmax等特性，并筛选一组底物的转运活性。尽管最初对能否超越放射性标记底物持悲观态度，但SURFE2R N1平台的电生理实验立即奏效，在初始培训期间的试点实验中就观察到了非常稳健的电流，收集的数据与已知的转运蛋白信息一致，并能通过筛选大量结构相关底物推动项目向新方向发展。

技术对比与支持

• 技术对比
  团队曾使用荧光和放射性标记摄取实验，但在本项目中不适用。固体支持膜（SSM）电生理技术取代了放射性标记底物实验，带来诸多好处，如减少资金投入、实验速度更快、减少监管问题，且研究生更偏好该技术。
• 未来项目
  计划将SURFE2R N1用于微生物氟化物通道研究，利用其高灵敏度在更低底物浓度（几微摩尔）下监测电流，以探究亚饱和离子浓度下的通道功能；同时，有同事咨询将其用于细胞器或膜囊泡中转运蛋白或离子通道电流的测量。