细胞器电生理学研究：利用SyncroPatch 384、SURFE2R N1和SURFE2R 96SE测量溶酶体TRPML1通道

重要意义

? 溶酶体对维持细胞稳态至关重要，其功能障碍与多种疾病相关。鉴于直接的医学相关性，当前亟需对溶酶体进行高通量电生理研究。

? Oria生物科学公司开创了一种新型溶酶体分离技术，可批量制备高纯度、"即用型"的LYSO-Preps制剂。

? 我们已通过SyncroPatch 384、SURFE2R N1和SURFE2R 96SE系统，成功对过表达TRPML1通道的LYSO-Preps进行了特征化研究，包括激活剂/抑制剂的药理学分析及腔内pH敏感性测试。

引言  

功能表征溶酶体离子通道的金标准仍是对从单个细胞分离的膨胀溶酶体进行手动膜片钳记录[1]。该技术耗时且具有挑战性，但其他电生理技术正开始克服这些难题，实现了对分离溶酶体的更高通量表征。其中一项技术是自动化膜片钳（APC），它使用平面玻璃基底进行全溶酶体膜片钳记录。使用APC时仍需从细胞中分离溶酶体，这一过程可能耗时较长，且需要精确计时才能与APC有效配合。另一项评估溶酶体离子通道的技术是基于固体支撑膜的电生理学（SSME）。这一新兴方法已成功用于记录通过连续离心步骤分离的天然溶酶体。

近期，Santinho等人5报告了一种新型细胞器分离方法。该技术通过高通量流体硬件分离工艺，可获得高纯度的大型单个细胞器群体。这一突破性发明促成了Oria Bioscience公司的创立，该公司为科学界提供溶酶体、内体、内质网和线粒体等高纯度细胞器制剂。

Oria Bioscience与Nanion Technologies现已开发出检测方法，用于表征过表达黏脂素TRP通道1(TRPML1)的分离溶酶体——该通道是溶酶体中主要的Ca2+通道[6,7]。TRPML1基因功能障碍与多种疾病相关，包括IV型黏脂质贮积病(MLIV)或尼曼-匹克病，这凸显了TRPML1及其他溶酶体膜蛋白的医学重要性——这些蛋白可能成为新医疗策略的潜在治疗靶点。

因此，利用高通量电生理技术在原生环境中研究细胞内离子通道及其药理学特性引起了广泛关注。为此，自动膜片钳(APC)和固体支撑膜电生理(SSME)技术正越来越多地用于记录完整溶酶体膜中的离子通道和转运蛋白活性。本报告中，我们使用SyncroPatch 384、SURFE2R N1及SURFE2R 96SE仪器，对Oria Bioscience提供的LYSO-Preps样本进行了功能性表征。

实验设置

由Oria Bioscience提供的HEK细胞源LYSO-Preps（即用型扩大溶酶体）包含内源性通道或过表达的TRPML1通道。使用SyncroPatch 384系统进行记录时，NPC-384T nanoS型耗材（1x；产品编号：22 2111）对实验成功至关重要，该耗材专为在记录过程中支持和维持溶酶体完整性而设计。过表达溶酶体标记物TMEM192的LYSO-preps如图1A所示。典型LYSO-Prep中的溶酶体直径分布如图1B所示，范围在数微米之间，表明用于APC记录的大部分溶酶体直径超过2微米。

得益于高效分离流程，Oria Bioscience提供的SyncroPatch 384记录样本通常含有2x10?个溶酶体，稀释至每毫升20万个溶酶体的密度，足以完成多个SyncroPatch 384芯片（>5个）的实验。使用SURFE2R仪器的研究则无需在传感器（直径3毫米；N1产品编号：161001，96SE产品编号：181001）上应用前通过vacuolin（或其他试剂）进行预扩大处理。

天然LYSO-Preps（未扩大溶酶体）经Bradford法测定总蛋白浓度约为2 mg/ml（数据未显示），保存于-80°C直至使用。如图1C所示，Western blot分析证实Oria LYSO-Preps具有高纯度和高密度，未出现基于离心分离方法常见的其他细胞器或质膜污染问题10。

对于SyncroPatch 384记录，我们还采用了低细胞（溶酶体）密度测量方法，溶酶体数量减少且体积缩小，同时保持较高的捕获率。该方法使我们能够在"全溶酶体"模式下实现稳定的溶酶体封接，整个实验过程中封接电阻始终超过0.2吉欧。这种稳定性对于生成累积剂量反应曲线和实现腔内溶液交换至关重要（图1D、2和3）。这与SURFE2R仪器不同，后者的记录基于传感器表面汇总信号（电流），其信噪比取决于样品消耗量与所需信号幅度之间的平衡。

图1 A 展示从过表达hTMEM192-EGFP的HEK293细胞中分离的溶酶体图像，这些溶酶体经vacuolin扩大后包含在标准LYSO-Prep试剂盒中。采用明场/荧光显微镜（X63油镜）拍摄。B 展示经1μM vacuolin扩大后瞬时过表达hTMEM192-EGFP的分离溶酶体尺寸分布示例。仅使用FIJI软件分析可封接溶酶体（>1μm）。C 呈现纯化前（细胞提取物）与纯化后（LYSO-Prep及剩余提取物）不同细胞区室标记蛋白的典型免疫印迹。D 展示全溶酶体记录的SyncroPatch 384实验示例，采用从-100至100mV的斜坡协议（保持电位0mV），并标注ML-SA1与NMDG溶液的施加情况。插图：简化示意图显示溶酶体被吸引至膜片钳孔径的过程。

结果：

APC图1D展示了达到全溶酶体构型（腔内pH值7.2）后的典型记录，我们通过向胞质溶液添加特异性激活剂ML-SA1来激活TRPML1电流11。随后，应用非渗透性阳离子NMDG导致内向电流部分被阻断，使反转电位发生约30 mV的游走性变化（数据未显示），这凸显了TRPML1作为阳离子选择性通道的特性。

鉴于已知溶酶体离子通道的pH依赖性，以及某些通道在溶酶体酸性pH条件下的质子渗透特性，我们采用管腔内溶液交换法来测定野生型（WT）和过表达TRPML1溶酶体的pH敏感性（图2A）。如图2B所示，当施加pH值更低的管腔内溶液时，野生型和过表达TRPML1的溶酶体均表现出外向电流和内向电流的增加。将观察到的电流增幅归一化至最大反应值，并通过希尔方程拟合数据，得出在+100mV和-100mV条件下的EC50[pH]（±标准差）：野生型溶酶体分别为5.0±0.7和5.1±0.9，过表达TRPML1的溶酶体分别为6.1±0.7和5.8±0.9。我们还测定了典型成功率（野生型与过表达TRPML1溶酶体相似），在单次实验中对166个溶酶体记录施加了密封电阻>200MΩ、-100mV电流<-150pA的质量筛选条件后，最终成功率为43.2%。

接下来，我们在管腔内pH值为7.2的条件下进行了药理学实验，使用了已知的激活剂（ML-SA1、MK6-83）和抑制剂（ML-SI3），如图3A中SyncroPatch 384设备记录的轨迹所示。为测定这些化合物的半数有效浓度（EC50），我们采用4个递增浓度的ML-SA1进行了累积剂量反应实验，并在实验结束时使用ML-SI3来抑制电流。实验（图3B）。对类似记录数据进行希尔方程拟合后的标准化响应显示，ML-SA1在+100mV和-100mV条件下的EC50值（±标准差）分别为5.5±2.9μM和4.8±2.9μM，而MK6-83的对应值分别为1.8±1.2μM和2.5±1.3μM（图3C）。两种化合物在ML-SA1和MK6-83作用下的各电压数据均未表现出显著差异，这与文献11,12,13报道数值相符。图3D对比了TRPML1过表达溶酶体在-100mV时的电流分布：使用最高浓度ML-SA1（30.69μM）在腔内pH7.2条件下激活产生的平均电流为-312pA（n=96），而腔内酸性pH（4.5）激活产生的平均电流为-317pA（n=214）。经t检验，观测数据无显著差异，表明腔内酸化与ML-SA1药物激活具有相似的刺激效能。

结果：

固态膜片电泳技术（SSME）为深入分析和验证Oria Bioscience公司提供的LYSO前体制剂的通用性，我们采用了基于固态支撑膜电生理学的SURFE2R仪器系统。该技术兼容多种膜制备样本（包括含有目标蛋白TRPML1的溶酶体或其他细胞器），通过脂质层将这些膜泡附着于直径3毫米的金传感器表面（图4）。相较于膜片钳技术，此方法不仅能在天然环境中研究溶酶体通道蛋白（如TMEM175）且无需依赖溶酶体膨胀，样本更可保存数月而不影响记录质量或需持续维持细胞培养。SSME技术通过溶液交换提供底物或配体来激活转运蛋白/通道蛋白，所产生电荷位移被检测为瞬态电容电流并进行后续分析。表1中我们详细对比了膜片钳与SSME技术在方法论上的差异。

TRPML1是溶酶体上主要的Ca2+渗透通道6,7。因此，所有SSME实验都从施加2 mM Ca2+开始，以刺激TRPML1介导的Ca2+电流。

图3 A 展示了一个来自扩大的（空泡化）分离溶酶体的SyncroPatch 384记录示例，这些溶酶体过表达TRPML1通道蛋白，经ML-SA1激活后被ML-SI3抑制。B 显示在施加浓度递增的ML-SA1后，于-100 mV电压下记录的电流变化，以及超过23分钟时间过程中ML-SI3的抑制作用。C 箱形图呈现了在微摩尔低浓度范围内，ML-SA1和MK6-83存在时，基于-100 mV平均电流响应（希尔方程）计算得出的EC50值。D -100 mV下的电流分布显示，在最高使用浓度（30.69 μM）的酸化处理或ML-SA1刺激后，未出现显著差异（t检验）。

随后我们在抑制剂和增强剂存在条件下重复钙离子激活实验，通过调节钙离子电流进一步研究TRPML1的药理学特性。图5C显示随着ML-SA5浓度升高产生的剂量依赖性激活效应，导致钙离子电流逐步增强。图5E展示了在SURFE2R N1平台上未添加化合物时，电流强度相对于钙离子响应的归一化数据。通过希尔方程拟合得出EC50值为22±9 nM，该数值略低于先前在转移性黑色素瘤组织中报道的研究值14。值得注意的是，在未过表达TRPML1的分离溶酶体记录中，ML-SA5对电流未产生显著影响，这凸显了该检测体系的高灵敏度。

我们将该检测方法转移至高通量SURFE2R 96SE平台。结合高达99%的成功率，该方法能在不影响药理学参数的前提下（图5F，EC50=33±22 nM），实现检测样本量的大幅提升（单板可完成95次记录）。在相同条件下，我们使用N1平台研究了ML-SI3的抑制效应，测得IC50值为0.74±0.1 μM，该结果与文献15报道高度吻合。这些数据与SyncroPatch 384平台的结果相互印证，证实了这些化合物对TRPML1的特异性作用。无论是APC还是SSME技术，对ML-SA1、MK6-83及ML-SI3的检测结果均与文献报道一致。据我们所知，此前尚未有关于ML-SA5处理分离细胞的EC50值报道。

结论：

我们在此首次报告使用来自Oria Bioscience的新鲜分离、运输即用型（无需细胞培养）溶酶体。通过APC和SSME两种不同技术成功对样本进行表征，证实其适用于高通量研究。由于SURFE2R 96SE设备接近100%的成功率，该技术极其适合制药行业的药物开发应用。Oria Bioscience提供的样本是高度纯净、均质且可靠的优质溶酶体来源，我们可跨设备使用这些样本获得与文献相符的EC/IC50值。这有助于更深入理解溶酶体通道功能及其作为治疗靶区的作用，同时规避了使用异源表达系统（在质膜表达这些通道）或间接记录方法可能产生的局限性。我们采用该方法记录了野生型及TRPML1过表达溶酶体的电流，发现TRPML1过表达使溶酶体内腔pH敏感性向碱性方向偏移约1个pH单位。通过特异性药理试剂（ML-SA1/5、MK6-83、ML-SI3）和严格质量控制，我们验证了记录数据的有效性。在SURFE2R仪器上的实验同样证实：使用同一批次未扩增的溶酶体样本即可验证TRPML1的药理特性，而未过表达溶酶体的对照记录中未检测到信号。

我们的研究结果明确表明，将NPC-384T纳米S型芯片与SyncroPatch 384低细胞密度方法相结合，并配合使用SURFE2R仪器，将为溶酶体通道的电生理研究提供高效且经济实惠的技术手段。

我们期待这一技术能够扩展至其他类型细胞器和细胞内区室中表达的各种离子通道，正如Santinho等人5的研究所展示的那样，这凸显了Nanion设备广泛的应用潜力。

图4 A 镀金3毫米SURFE2R传感器的示意图，附着有多个溶酶体。B 覆盖金传感器的固体支撑膜（SSM）放大示意图。在0 mV条件下，通过2 mM Ca2+浓度跃升刺激TRPML1介导的Ca2+内流。由此产生的瞬态电流通过溶酶体膜与SSM的电容耦合被记录，峰值电流对应稳态条件下通过TRPML1的Ca2+通量。

方法：

溶酶体分离 LYSO-Preps 包含扩大（1μM vacuolin）或未扩大的溶酶体，数量为2x107个（用于APC）或蛋白浓度约2mg/ml（用于SSME）。LYSO-Preps由Oria Bioscience（https://www.oriabs.com）及其专有平台生产提供，该平台按照先前描述的方法5从HEK细胞中分离溶酶体。

方法：电生理学APC全细胞膜片钳记录按照Nanion公司SyncroPatch 384的标准程序进行。所有实验均在室温（21°C）条件下完成，使用平面硼硅酸盐玻璃芯片及NPC-384T纳米S型芯片（1x；产品编号：22 2111）。溶酶体在施加电压斜坡协议前保持0 mV的钳制电位，该协议在1秒内从-100 mV线性变化至100 mV。此操作每5秒重复一次，采样频率为5 KHz，未进行漏电流扣除。为估算半数有效浓度（EC50），电流值均归一化至最大响应值，并通过希尔方程进行数据拟合。更详细的实验流程可应要求提供。

方法：

电生理学SSMESSME记录采用SURFE2R N1仪器和SURFE2R 96SE高通量设备（该设备可同时测量96个传感器，成功率接近100%）在持续溶液流条件下完成。对于SURFE2R N1，每个传感器通过添加约0.5微克总蛋白（采用布拉德福德法测定）进行制备。SURFE2R 96SE的传感器板包被和化合物板制备则根据Nanion标准方案直接在仪器上完成。通过将溶液从非激活液（含额外4 mM氯化胆碱）切换至激活液（补充2 mM氯化钙），在0 mV条件下刺激TRPML1介导的钙离子内流。增强剂和阻断剂通过用1 ml非激活液冲洗传感器并在测量前孵育3分钟的方式添加，这些物质在测量过程中同时存在于非激活液和激活液中。更详细的实验流程可应要求提供。

图5 A SURFE2R N1平台采用单孔格式进行SSME记录（左图）。用于SURFE2R N1记录的3毫米传感器（中图）。SURFE2R N1控制软件1.7.0.2界面截图（右图）。B SURFE2R 96SE平台采用高通量格式进行SSME记录（左图）。配合SURFE2R 96SE使用的96传感器微孔板（中图）。SURFControl 96 1.7软件界面截图（右图）。C 使用相同3毫米传感器记录的代表性电流轨迹，测试不同浓度的TRPML1增强剂ML-SA5。D 将SURFE2R N1记录的峰值电流归一化至未添加ML-SI3时的峰值电流，取平均值获得均值与标准差。通过标准希尔方程拟合数据获得IC50和Imax值。使用未过表达TRPML1的HEK293细胞纯化溶酶体进行相同实验与分析，最高抑制剂浓度下未观察到显著效应。最高阻断剂浓度下的残余电流（Imin）反映钙离子结合膜产生的背景电流，可扣除后获得TRPML1净电流。E 将SURFE2R N1记录的峰值电流归一化至未添加ML-SA5时的峰值电流，取平均值获得均值与标准差。通过标准希尔方程拟合数据获得EC50和Imax值。F 使用SURFE2R 96SE平台重复E项实验，拟合算法与归一化方式同E。