本研究采用Nanion SURFE2R N1固体支持膜电生理学技术，对副溶血性弧菌钠/半乳糖共转运蛋白（vSGLT）进行了非放射性动力学表征，旨在系统验证其底物选择性、钠依赖性及相关动力学参数。

研究的主要内容

底物特异性  

·D-半乳糖的响应：在含Na?的缓冲液中，D-半乳糖可激发显著的钠依赖性瞬时电流，峰值电流幅度约为3–4 nA。该电流随D-半乳糖浓度升高而增加并趋于饱和；而在K?缓冲液中则未观察到显著响应。上述结果表明，vSGLT对D-半乳糖的转运具有严格的Na?依赖性，且D-半乳糖为其最适底物。  

·其他糖的响应：通过对D-葡萄糖、D-岩藻糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-葡萄糖及D-木糖的测试，发现vSGLT的底物偏好顺序为D-半乳糖 > D-葡萄糖 > D-岩藻糖。其中，D-木糖与3-O-甲基-D-葡萄糖仅诱发最小电流响应，此结果与早期放射性标记摄取实验数据一致。 

钠依赖性  

·钠浓度对电流的影响：在20 mM D-半乳糖存在条件下，于0–500 mM NaCl浓度范围内测量峰值瞬时电流，结果显示电流与Na?浓度之间呈饱和关系，并在高Na?浓度时达到平台。在K?缓冲液中未检测到可测量的电流，进一步证实vSGLT转运过程具有严格的Na?依赖性。  

·动力学参数：通过扣除K?背景信号，计算得出表观Km（Na?）约为18.0±3.6 mM，Hill系数为0.7。该结果支持Na?与糖以1:1的化学计量比进行耦合转运，表明钠离子结合是转运体激活的关键步骤。  

糖浓度依赖性  

·不同糖的浓度-响应关系：在150 mM NaCl条件下，随着D-半乳糖、D-葡萄糖和D-岩藻糖浓度（0–128 mM）的增加，电流振幅相应增大并逐渐饱和，表现出典型的双曲线型动力学特征。  

·表观米氏常数：基于Na?特异性电流计算所得的表观米氏常数显示，D-半乳糖的Km约为9.8 mM，D-葡萄糖约为29.2 mM，D-岩藻糖约为44.9 mM。这些数值反映了vSGLT对不同糖类底物的亲和力差异，与先前研究中观察到的底物偏好顺序一致。 

图1. 利用SURFE2R N1平台测定的D-半乳糖跨膜转运动力学特征。

（A）在pH 7.5、150 mmol/L NaCl（黑色轨迹）或150 mmol/L KCl（灰色轨迹）缓冲体系中，向同一3 mm传感芯片施加20 mmol/L D-半乳糖所记录的代表性瞬时电流响应曲线。

（B）在相同pH与离子强度条件下，D-半乳糖浓度依赖性峰值瞬时电流响应：NaCl组（实心圆）与KCl组（空心圆）。数据以均值±标准误表示（NaCl组，n = 4；KCl组，n = 3）；拟合曲线采用三参数非线性回归模型（y = V_max × [S] / (K_m + [S]) + y_0）。结果表明，在Na?存在下，vSGLT介导的D-半乳糖转运呈现典型的饱和动力学特征，峰值电流随底物浓度升高而递增并趋于平台；而在K?替代Na?的缓冲体系中，仅检测到微弱背景水平的电流响应。为消除传感器间差异，各组峰值电流均归一化至其对应的最大响应值，并基于三个独立重复实验（n = 3）进行统计分析。该结果证实，基于固支膜（SSM）电生理技术测定的vSGLT转运活性具有严格的Na?依赖性，且其底物浓度响应特性与既往放射性同位素摄取实验所确立的经典药理学特征高度一致。

图4. vSGLT介导的糖类转运对底物浓度的依赖性。

（A）在150 mM NaCl、pH 7.5缓冲体系中，采用同一枚3 mm直径电化学传感器记录的D-半乳糖（蓝色）、D-葡萄糖（橙色）和D-果糖（灰色）典型瞬态电流响应曲线。

（B–D）在pH 7.5条件下，D-半乳糖、D-葡萄糖和D-果糖分别对应的Na?特异性峰值电流随浓度变化的关系曲线。所有数据均基于3 mm传感器测定，经归一化处理（以各糖类对应的最大响应值为100%），并取自三个独立重复实验的平均值；其中果糖组在含NaCl缓冲液中的重复数n = 4，其余糖类n = 3。Na?特异性电流通过差值法计算获得，即从含Na?缓冲液中测得的总响应电流中减去相应浓度下在等渗K?替代缓冲液中测得的背景响应电流。数据以平均值±标准误（SEM）表示；剂量–响应关系采用三参数Logistic非线性回归模型进行拟合。

总体结论  

SURFE2R N1固体支持膜电生理学技术为vSGLT的功能分析提供了一个可靠的非放射性平台，能够准确再现其核心动力学特性、离子依赖性及底物选择性。该方法通过直接测量电生理信号反映的Na/糖共转运过程，对经典放射性示踪实验形成了有效补充，为钠耦合转运体的功能表征提供了强大且广泛适用的手段。同时，本研究进一步巩固了vSGLT作为研究钠耦合转运机制的基准系统地位。