如何高效检测miRNA？

MicroRNAs（miRNAs）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA主要与靶基因mRNA3‘端非编码区域特异性结合，调控转录后靶基因mRNA的翻译过程，从而阻断mRNA翻译和促进mRNA降解导致蛋白质表达降低。miRNA的作用涉及个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种心血管疾病的发生发展。

图.miRNA体内合成示意

 

miRNA研究的关键是如何准确且特异性地检测分析miRNA。目前检测分析miRNA的方法中最为常用的是荧光定量PCR。但是miRNA本身相对较小，传统的RNA提取、反转录和定量方法难以高效的保证miRNA的检测，选对适配的方法此时则显得尤为重要。

 

传统的有机提取通常提取的是较大分子量的RNA，例如mRNA和核糖体RNA，但对于miRNA的提取效果则不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇类沉淀。针对这个问题，翌圣匠心研发了专门针对miRNA提取的产品-MolPure^® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒。

 

产品推荐

19331ES-MolPure^® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒

采用MolPure^® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液体系，适用于从多种新鲜或冻存的动物组织或培养细胞中快速提取各种小RNA。试剂盒内的MolPure^® RNA Column M1可选择性吸附核酸，不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质；microRNA Column M1则能从总RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。

产品性能

• 快速，简捷，可在30分钟内完成miRNA提取
• 不用乙醇沉淀，减少小分子RNA丢失

 

成熟的miRNA的长度只有20nt左右，通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分，反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。

加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链，后续扩增过程中，茎环结构在适宜的温度下会被打开，和相关扩增引物结合。

 

图. 加尾法合成miRNA

图.茎环法合成miRNA

 

 

类别	加尾法	茎环法
适用性	适合于同时研究多种不同miRNA的情况	适合对样本中少量几个miRNA的精确定量检测
优点	一次反转录可检测多个miRNA，通量高	一次反转录只能检测一个miRNA，特异性强
反转录体系	内参与miRNA一起，在同一个反应体系反转录，准确性高	内参与miRNA分开，在两个体系分别反转录，容易产生误差
检测特异性	★★★★☆	★★★★★
检测灵敏度	★★★★★	★★★★☆
实验时间	★★★★☆	★★★★★

 

 

产品推荐

翌圣miRNA加尾法反转定量组合（11148ES&11171ES)

11148ES-Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair^® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。

11171ES -Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

产品性能

• 可兼容全平台qPCR仪器

图. 以293T细胞的Total RNA为模板，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录，获得的cDNA稀释10倍后，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6内参基因。

• 检出率高，最高可达10 pg

图. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T细胞Total RNA(b)为模板，分别稀释成以下梯度： 60拷贝到60⁶拷贝（6个梯度）和10 pg-100 ng(5个梯度)，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录，获得的cDNA用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。

• 高特异性，能区分同家族miRNA间单碱基差异

图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA，以不用的引物，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA，利用公式2^-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示，可有效区分密切相关的亚型家族成员。

• 扩增效率出色

图. 以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板，扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示，与同类产品相比，Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系，具有优异的表现。

• 稳定性优秀，在 37℃稳定7天或冻融50次或配置体系在25℃保留48 h，效果依旧稳定

图. 以293T细胞Total RNA为模板用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 进行反转录，获得的cDNA稀释10倍，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况。△Ct<0.5。

 

翌圣miRNA茎环法反转定量组合（11139ES&11170ES)

11139ES-Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

该试剂盒基于Hifair^® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair^® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。

11170ES-Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量时对特异性要求极高。本品基于热启动的 DNA 聚合酶，配以优化的Buffer，能够极大地减少非特异性扩增；同时，特殊的ROX Reference Dye，使得预混液适应于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

• 可兼容全平台qPCR仪器

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA稀释40倍后，用Hieff^® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分别扩增人源的mmu-miR-125a基因。

• 灵敏度高，可达10 pg

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA 以10倍梯度稀释（范围10pg /μL-0.1μg /μL），扩增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

• 高特异性，能区分同家族miRNA间单碱基差异

图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。以不同的引物，使用 Hieff^® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分别扩增这些miRNA，利用公式2^^-△ct x 100%计算匹配率。

• 重复性好

图.以人293T细胞的Total RNA为模板反转录，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA稀释50倍，使用Hieff^® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）进行90孔平行重复实验扩增人源的hsa-let-7a基因。

• 稳定性好，37℃稳定14天或冻融稳定50次或配置体系在25℃保留24h后，效果依旧稳定

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA稀释100倍，扩增鼠源的mmu-miR-132基因。