前沿进展：通过微生理方法解决药物分子预测难题（二）-2

前沿进展：通过微生理方法解决药物分子预测难题

—第四届大西洋毒理学研讨会报告（二）-2

Biology-inspired Microphysiological System Approaches to Solve the Prediction Dilemma of Substance Testing

t4 Workshop Report-跨大西洋毒理学智库的报告，该智库由Doerenkamp Zbinden基金会赞助，由巴尔的摩、康斯坦茨和乌得勒支的毒理学负责人合作完成。本文所表达的观点是作者本人的观点，不一定代表他们的工作机构的观点。

May 15, 2016

翻译和整理：北京佰司特贸易有限责任公司

单器官MPS的其他器官模型包括小动脉（Günteretal.，2010）、神经系统（BoothandKim,2012；Brownetal.，2014；Kerman等人，2015；Neryetal.，2015；Parketal.，2009；Tayloretal.，2005），胰XIAN（Silvaetal.，2013；Junetal.，2013；Leeetal.，2012），肾脏（Snouberetal.，2012；斯努伯等人，2011年；zhangetal.，2013；Ferrell等人，2012；KimandTakayama,2015；Huangetal.，2013；Muetal.，2013）、骨SUI（Cuietal.，2007）、皮肤和头发（Ataçetal.，2013）和肠道（Eschetal.，2012；KimandIngber,2013；Kimetal.，2012；Kimetal.，2013a；木村等人，2008年；Lahar等人，2011年；马勒等，2009a；McAuliffe等人，2008年；Ootani等，2010；Sato等人，2009；Sungetal.，2011；Yuetal.，2012）在不同层次的生物复杂性。Gao及其同事（2013）设计了一种集成的微流控装置，直接与质谱仪耦合，以实时表征肠道屏障的药物渗透性。他们能够实时测量姜黄素通过Caco-2单层细胞的渗透情况，并获得与已发表的体内数据一致的结果。另一个集成的微流控平台“NutriChip”被建立起来，用于研究乳制品免疫调节功能的潜力（Ramadanetal.，2013）。Ramadan和同事在他们的上皮/免疫细胞共培养模型中，使用磁珠和光学检测设备直接在线量化了促炎细胞因子表达的变化。这些技术为物质渗透性研究或生理反应测量提供了有用的工具。最ZUI后，美国波士顿哈佛大学Wyss研究所的芯片肺平台最近被用于炎症性肠病的芯片肠模型（Kimetal.，2016）。该单器官芯片用于共培养与活的人肠道上皮细胞接触的多种共生微生物，并分析肠道微生物组、炎症细胞和蠕动相关的机械变形如何独立促进肠道细菌过度生长和炎症。该体外模型复制了过去动物和人类研究的结果，包括证明益生菌和抗生素治ZHI疗可以抑ZHI致病菌诱导的绒毛损伤。在维持管腔血流的同时停止蠕动样运动，缺乏上皮变形可触发细菌过度生长，这与在肠梗阻和炎症性肠病患者中观察到的相似。因此，这种芯片上的人体肠道可以用来分析微生物组对肠道病理生理学的贡献，并以一种可控的方式解剖疾病机制，这是现有的体外系统或动物模型无法实现的。

排泄系统，我们向读者推荐Perestrelo和合作者（2015）最近的一项系统综述，而使用单器官MPS模型疾病已经在其他地方进行了综述（Benametal.，2015a）。荷兰莱顿大学（LeidenUniversity）的Hankemeier及其同事（vanDuinenetal.，2015）最近对微流控和微工程3D细胞培养系统进行了一项调查，发现2012年至2015年初在MPS领域发表的大多数组织建模工作都集中在血管系统上。作者解释说，MPS是唯YI能够灌注此类血管的平台，因此包括至关重要的血流和伴随的剪切应力，这是血管建模的显著优势。MPS模拟微血管来研究血管生成（Bischeletal.，2013；Zhengetal.，2012）、通透性（Leeetal.，2014）、模式扩散梯度（Bakeretal.，2013）、微血管环境（Hasenbergetal.，2015；Kimetal.，2013b；Parketal.，2014；Tourovskaiaetal.，2014；Wangetal.，2014a）和血管对血管几何形状的响应（Yeetal.，2014）已经在过去几年发展起来。最后，血管MPS被用作动脉血栓形成的模型（Huhetal.，2007；Westeinetal.，2013）。Hankemeier和他的同事（vanDuinenetal.，2015）调查的另一个重要发现是，在2012年至2015年初发表的微流控癌症模型与上述微流控组织模型在数值上的份额大致相同。乳腺癌和肺癌模型占已发表癌症模型的一半，最近开发的许多癌症模型都包含血管成分。在这里，MPS技术再次提供了唯YI的平台，通过将人微灌注三维肿瘤模型与人血管系统相结合，来模拟肿瘤细胞进入替代血流或免疫细胞外渗到肿瘤中。这些系统增加了我们对肿瘤进展的理解。迁移（Haessler等人，2012；Hockemeyeretal.，2014）、体内渗滤（Zervantonakisetal.，2012）外渗（Bersinietal.，2014；Jeonetal.，2013）和转移（Griepetal.，2013）已经在这种基于mps的肿瘤模型中进行了研究。

2.3.3多器官系统微生理发育

将单器官模型结合到集成的多器官配置中，将复杂性提高到器官相互作用的系统水平。设想使用这种多器官系统来模拟人体器官间的串扰、ADME途径和器官间的系统调节回路。它们的发展对基于板和芯片的格式都提出了重大挑战。不同的器官模型必须在同一设备中处理，同时保持完全功能，并通过相同的循环液相相互作用。这些挑战提高了对使用多器官MPS生成对人类具有可重复性和预测性结果的工具和方法的资格要求。为这些系统模型选择的任何基于板或芯片的MPS技术都是在复杂性和体内相似性与易用性、重现性和并行化潜力之间的权衡（vanMidwoudetal.，2011b）。瑞士苏黎世联邦理工学院和InSpheroAG的OlivierFrey团队及其合作者率先开发了多器官板概念，使用3D微组织球体作为3D组织模型（Kimetal.，2015a；Kim等人，2015b）。微流控平台的搭建方式是将微组织发育与微流控培养完全解耦，并以模块化方式实现椭球加载（图8A）。平板由直通道组成，连接多达10个相同的隔间，在其中球体可以使用简单的移液加载。介质通过平台周期性倾斜，以重力流的方式在两个横向介质储层之间灌注。单个平板包含多达10个通道，因此在单个倾斜装置上可以测试多达60个多器官条件（图8B）。人体组织球具有固有的器官型功能和仿生形态，可以在离线自动化系统中精确、可靠、灵活地制造。它们的球形形状使其易于操作，并使基于板或芯片的MPS易于操作和耐用的发展成为可能。使用椭球体的多器官排列可以以一种非常灵活的方式建立，对于可以形成椭球体的大量细胞类型，以代表不同的器官模型和许多椭球室的流体互联系统。因此，无需对微流控测试平台本身进行重新设计，就可以对椭球模型进行不断改进和进一步发展。虽然在按照生理顺序安排不同器官模型以及根据引入系统的球体数量调整不同组织体积和比率方面提供了很大的灵活性，但这种方法的局限性在于球体模型本身。球体通常被认为是最ZUI小的功能组织单位。然而，很明显，球体不包括机械线索（动态力量，如呼吸紧张），也不血管化。因此，基于球体的多器官模型将主要关注不同组织类型之间的生化和代谢相互作用（例如，将代谢肝脏功能添加到生物激活应用中）。为概念证明（Kimetal.，2015a；Kim等人，2015b）联合结直肠肿瘤微组织（HCT-116）培养原代大鼠肝组织超过8天。有趣的是，与静态培养条件相比，在流体设备中，大鼠肝脏微组织的白蛋白分泌在最初几天增加，这表明在芯片中流动条件下组织进一步成熟。环磷酰胺是一种前体药物，需要肝脏代谢（主要是CYP2B6）激活才能发挥作用，通过应用环磷酰胺证明了肝脏和肿瘤组织相互连接的重要性。在静态培养条件下，采用移液方案进行离散液体转移，并在芯片上灌注条件下，同时评估环磷酰胺对肿瘤生长的影响。值得注意的是，在静态培养条件下几乎没有观察到对肿瘤生长的任何影响，而在芯片中直接和连续的流体耦合情况下，环磷酰胺处理后微肿瘤明显变小。这些发现说明了不同组织或组织间隔间液体和代谢物连续转移的重要性。在孤立的椭球结构中，这种转移只能通过频繁的离散介质交换来实现。然而，适当的转移时间和足够长的培养时间来获得所需的代谢化合物是很难估计和优化的。此外，相对较大的井量的传统设置可能导致活性代谢物的稀释过大。在同一孔中共培养球形细胞，增加细胞-培养基体积比，短时间内会导致组织不可控融合。研究结果进一步证明，使用已经是劳动密集型的移液协议的井格式无法再现通过连续介质交换获得的结果，正如仅包括两种不同组织类型的设置所示。移液方法不再是需要两种以上不同组织类型的实验方案的选择，因为各自的协议变得非常复杂，而微流控网络提供了可行的解决方案。这种基于板的MPS技术（InSphero,2012）将由瑞士InSphero公司商业化。

图8：基于平板的多器官系统的例子(A)、96孔格式的多组织相互作用测试芯片(特写显示带有装载端口的球形室)。10条平行微流通道连接6个培养室，可装载不同类型的球体。 (B)、在标准培养箱中操作的平台，使芯片前后倾斜，在不同培养室之间产生重力引导的流动。 (瑞士联邦理工学院ETH提供)  

同一组的另一种方法包括使用悬挂滴本身——形成球体的主要技术——作为芯片上培养室（Freyetal.，2014）。悬挂液滴阵列与功能性悬挂液滴网络相连，介质可在液滴之间灌注，并连接不同类型的球体。该平台结合了不同细胞类型球形细胞的形成和培养，由于球形细胞位于液-气界面上，因此不存在粘附和功能丧失的风险。基于阵列的格式能够进行并行的多组织实验，并允许重现上述环磷酰胺生物活化研究。芯片上搏动微泵的集成，其卒中率已与人类ips衍生的心脏球体的跳动同步，最近将心脏“添加到悬挂-滴网络技术中”（Rismani等人，2015）。

另一种基于平板的系统已被用于研究paracetamol的肠首通代谢和继发性肝脏代谢，使用CaCo-2和HepG2/C3A细胞共培养超过24小时。（Prot等人，2014）。结果表明，扑热息痛通过肠道单位运输，随后通过肝脏和肠道单位生产硫酸扑热息痛进行协同代谢。肝共培养时检测葡萄糖醛酸对乙酰氨基酚。

美国康奈尔大学的michaelShuler小组率先开发了人体多器官芯片（moc）。早在2004年，他们就开发了一种基于芯片的微型微细胞培养模拟物（μCCA），用于药代动力学/药效学（PK/PD）建模（Sinetal.，2004）。该系统支持基于生理的药代动力学、定量构效关系（QSAR）研究和定量体外到体内外推（QIVIVE）建模。它将不同的人体组织培养物组合成一个共同的培养基流，用于预测亲代化合物及其代谢物的时间依赖性浓度。系统的原理设计如图9所示。它依赖于普通培养基的再循环，每个培养室约有10,000个细胞，接触物质的次数可达4天。

图9：芯片尺寸为25 × 25 mm，通道宽度为20 ~ 100 μm。  流动是层流的，通常每个组织培养室有超过10,000个细胞。 该设计基于哈根泊Poiseulle定律，允许将每个通道中的类人流体速度和液体在每个隔间中的停留时间与硅中的PKPD模型相匹配。 (Marx等人2012年修改)  

萘作为模型毒物的研究证明了这一概念（Viravaidyaetal.，2004）。此外，两种使用阿霉素（TatosianandShuler,2009）和替加呋（SungandShuler,2009）的联合疗法已经在μCCA的人体癌细胞株上进行了测试，这是专门为物质检测应用而开发的。在选定的规模下，该系统提供了培养室之间的类体内组织质量比，培养基流入分裂，相当于人体各自的血流分裂，以及相关的组织间隔停留时间。此外，该微流控芯片设计据称支持生理剪切应力和液体与细胞的比率，模拟各自的器官。它的运行周期可长达四天。该平台由美国Hμrel公司商业化。μCCA的布局多年来一直在发展（Mahleretal.，2009a；马勒等人，2012；马勒等，2009b；Sungetal.，2010；songandShuler,2010）。2012年，将μCCA技术推进为常规检测分析平台，总结了以下问题（Shuler,2012）:

---采用基于重力的介质流的“无泵”芯片设计，避免任何泵系统；

---监控外围的改进；

---有关的机械力或电耦合的维护；

---改进普通培养基，使之成为更逼真的代血剂；

---从3D人类细胞系构建到初级人类类器官的细胞培养室的器官典型性改进，解决其特定的ECM结构、上皮屏障、基质组织影响、生理吸收和水的分泌或蒸发动力学。

Shuler的团队最近提出了一种基于μCCA平台的双器官芯片，通过CaCo-2细胞和粘蛋白产生细胞系TH29-MTX的共培养模拟胃肠道，通过HepG2/C3A细胞系培养模拟肝脏（Esch，2014）。这个肠肝芯片暴露在纳米颗粒中24小时。结果表明，摄入羧基化聚苯乙烯纳米颗粒有可能导致系统肝损伤。下一步，MichaelShulers小组开发了一种用于毒性测试的四器官芯片（Oleago，2016）。最近介绍了一种低成本无泵重力驱动流动系统，用于在一个共同定义的培养基中维持人类心脏、肝脏、骨骼肌和神经元的存活和功能培养两周。选择这些细胞类型是为了深入了解人体组织在应对阿霉素、阿托伐他汀、丙戊酸、对乙酰氨基酚和n-乙酰氨基酚等具有明确毒理学特性的挑战时的重要代谢和功能变化。所提供的数据显示了所有4种人类细胞类型在流动培养14天期间的存活和持续功能，以及它们对单剂量48小时药物暴露的反应。所有药物治疗的结果与已发表的人类和动物数据的毒性结果基本一致。所提出的表型培养模型显示了多器官毒性反应，并向体外“人-芯片”全身毒性筛选试验迈出了一步。Shulers实验室开发的最ZUI新原型是一个10个器官的原型，在本报告的第4章中说明。针对不同人体组织在芯片上的系统排列的一系列其他moc已经出现。μOrgano是一种可定制的、类似乐高的即插即用系统，它可以使单个器官芯片系统的初始个体培养和随后的连接创建集成的多器官微生理系统（2015）。作为概念的证明，μOrgano系统被用于串联多个心脏芯片，具有良好的细胞活力和自发的生理跳动率。多组织排列的实验正在进行中。Zhang和来自新加坡生物工程与纳米技术研究所的同事开发了一种多通道3D微流控细胞培养系统，提供了四个独立的基于通道的细胞培养空间，每个空间可以装载数万个细胞（Zhang，2009）。将人肝、肺、肾细胞系和原代人脂肪细胞排列在直接剪切应力屏蔽的微通道中，模拟内皮壁在体内的剪切应力保护。再循环流速为0.2mL/min，暴露时间为2天，转化生长因子β1可导致人肺细胞的独立生物学反应，而其他室则未受影响。Imura和应用生物化学系的同事报道了另一种用于模拟人乳腺癌细胞的肠道吸收、肝脏代谢和毒性反应的综合系统解决方案，该方案使用了常用的四种药物，东京大学农业和生命科学学院（Imura，2010）。他们的系统提供了芯片格式的单向流动，即显微镜载玻片的面积。它支持数以万计的人HEPG2细胞系为基础的肝细胞和人MCF-7细胞系为基础的人乳腺癌细胞连续排列在一个微通道中进行持续灌注。药物通过一个紧密封闭的人cco2细胞系肠道上皮细胞单层提供到肝腔室前通道的介质流中，模拟人体肠道的吸收特性。在0.4μL/min的流速下，暴露时间为2天，对人乳腺癌细胞有离散的生物学效应。异环磷酰胺的肾毒性在肝-肾共培养MPS中进行了超过72小时的研究，与静态比较（Snouber，2013b）。结果表明，在HepaRG-MDCK细胞肝肾微流控共培养模型中，异环磷酰胺的肾毒性是由异环磷酰胺代谢成氯乙醛引起的。本研究展示了多器官系统检测次生代谢物毒性的能力，结合了以人细胞系为基础的肝脏模型和第二个靶器官，在本例中是肾脏。

Gordana Vunjak-Novakovic和她的同事正在开发一种HeLiVa多器官平台，该平台具有从单系人类多能干细胞衍生出来的功能连接血管、肝脏和心脏微组织（Vunjak Novakovic等，2013）。从一个供体来源获得多器官系统所需的所有细胞类型的能力是向具有免疫能力的多器官系统发展的一个非常重要的先决条件，以避免该系统中由于供体不相容而产生的器官排斥。该平台能够结合实时生物读数（通过所有三种细胞表型的成像和同源报告）和高通量/高含量分析的兼容性，实现人体生理学的功能表征。用于血管、心脏和肝脏微组织形成和培养的微流体平台的首批原型目前正在评估中，以证明人类iPS细胞衍生的微组织在生理和药理研究中的效用。

为了克服在上述所有泵基moc中使用外部泵和储液器所造成的非生理流体-组织比，柏林科技大学的UweMarx团队和他们的合作者在显微镜载玻片区域的标准化芯片格式下设计并原型化了MOC平台（图10），该平台配备了一个强大的芯片上蠕动微泵，由Wu和同事（2008）改进。

图10：多器官芯片平台（A）一个3毫米高的PDMS芯片（黄色），连接在显微镜载玻片上，承载两个独立的微电路，其循环通道为100 × 500 μm。 每个通道连接两个组织培养室，支持3D组织的整合，如细胞球体和标准96孔插入重建屏障器官模型。蠕动式片上微泵（黑色）可实现生理频率下的脉动单向流体流动。 （B）代表两个血流灌注的回路。（转载自Marx等，2012年）  

它支持介质通过一个、两个或更多的组织培养室以接近活体速率和脉冲频率的脉动再循环。此外，该MOC平台的器官培养室普遍支持3D细胞球体的培养，重建的组织等效物，如培养小室的皮肤或肠，以及供者来源的组织外植体或活检组织。该平台旨在使共培养的人体器官模型在至少28天内保持长期稳态，以实现全身重复暴露于药物中。可以建立一个健壮的、可重复的28天人类HepaRG-Stellate细胞球体与基于插入的人类皮肤活检相连接的共培养过程，每个球体的生物量是原始人体器官对应的1/100,000（Wagner，2013）。在片上共培养过程中，可在气液界面维持皮肤功能。此外，系统中总液体-组织比支持组织串扰，这可以从皮肤消耗肝组织产生的白蛋白看出。最后，共培养显示了对重复剂量暴露宇曲格列酮（一种因药物致肝损伤而退出市场的糖尿病药物）6天的剂量依赖性毒性反应。另一种使用MOC平台的双器官共培养旨在将描述的3D肝脏模型与商业可用的重建人3D小肠模型相结合（Maschmeyer，2015a）。与CaCo-2屏障相比，这旨在增加屏障的人体器官类型，并提高其稳健性和工业适用性。在为期3天的无给药适应期后的11天内，采用了一种可重复且易于执行的口服物质给药de方案，从而在重复剂量试验条件下获得连续两周的MOC表现。免疫组化转运蛋白、屏障完整性的经上皮电阻测量和基因表达分析显示，肠屏障功能稳定，而曲格列酮治疗降低了肝球体中白蛋白mRNA的表达。

使用同一平台反复将人肝脏和神经元球体与己二酮进行长期共培养（Materneetal.，2015）。因此，将上述肝球体与人神经元球体共培养14天，使用NT2细胞系在搅拌槽生物反应器中预形成并分化，每天暴露于不同剂量的己二酮中，持续8天。共培养的敏感性谱可以与单器官芯片的反应进行比较，显示出更高的敏感性水平。最后，在生理流体流动条件下，建立了将生物血管系统集成到MOC平台微流体通道中的健壮程序（Schimek，2013）。因此，MOC平台适合于结合人原代或基于细胞系的3D微组织在稳态条件下长期重复剂量物质评估。该产品由德国柏林TissUse公司商业化。快速原型工具允许对moc进行灵活调整以适应任何新格式。因此，28天四器官共培养最近已建立在MOC格式，旨在人类器官型ADMET测试芯片（Maschmeyer，2015）。重建的人小肠与肝球体模型、气液界面皮肤活检和人近端小管细胞单层屏障连接。在28天的共培养过程中，所有的人体组织都保持了较高的细胞活力和离散的生理组织结构。人小肠上皮形成稳定的三维绒毛状结构，高度可达270μm，顶端呈刷状。皮肤活组织检查在气液交界面发现成层角质层。人近端小管上皮维持功能性极化单层屏障。小肠和肾近端小管细胞屏障能够在肠腔、代理血液循环和排泄循环之间保持持续稳定的葡萄糖梯度平衡。此外，深入的代谢和基因分析显示，在所有四种组织之间至少28天内建立了可重复的稳态，独立于用于每个器官当量的单个人类细胞系或组织供体背景。该四器官芯片被设计用于支持物质的ADME分析以及候选药物的重复剂量全身毒性测试。对生理吸收、首次通过代谢、药动学和药效学参数，如有效浓度、最ZUI大耐受剂量、时间过程、治疗和不良反应的强度进行评估。最后，该系统可能支持肠和皮肤室的损伤和再生的研究，因为它们在系统中稳定的生理周转。UweMarx实验室MOC的下一步发展是一个10个器官的原型，见本报告第4章。

麻省理工学院的Linda Griffith实验室和哈佛大学Wyss研究所的Donald Ingber实验室正在开发其他集成两个或两个以上器官的多器官系统，由美国国防部高级研究计划局/国家卫生研究院/食品和药物管理局资助。两组患者都向项目评估委员会成功地证明了几种双器官芯片变异（如MIT肝/免疫、肠道/免疫、子宫内膜/上皮和肺/气道MPS）。此外，麻省理工学院团队最近向DARPA/NIH/FDA提交了一个四器官平台的进展，该平台实现了两周的生存能力和功能。美国国防部高级研究计划局/美国国立卫生研究院/美国食品和药物管理局的计划在本报告的第4章中有更详细的描述，这是在开发人体芯片平台的背景下，旨在在体外模拟人体生物学的有机体复杂性。

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