【知识干货】破骨细胞分化实验终极指南：RAW264.7细胞的那些坑，我们帮你填平了！
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RAW264.7细胞系是小鼠单核巨噬细胞的重要模型，广泛应用于破骨细胞分化研究例如：骨代谢疾病机制研究（如骨质疏松、关节炎）、 破骨细胞功能与药物靶点筛选、 骨组织工程与再生医学模型构建等。然而，实验过程中常因细胞状态、诱导条件、污染控制等因素导致分化失败。
细胞培养相关问题
答：影响，RAW264.7细胞作为单核/巨噬细胞系极化（图一）受多种实验变量的精密调控，其核心影响因素包括细胞接种密度、培养基组分，以及冻存-复苏过程中细胞膜完整性及受体稳定性的损伤。
解决方案：大多数情况下会存在少量极化的细胞，保持良好的细胞状态，依然可以用于破骨诱导。（RAW264.7细胞需要的诱导状态图二）
1.细胞接种密度：调整细胞培养密度；
2.传代方式：不可使用胰蛋白酶消化或细胞刮板建议使用移液器或巴氏吸管轻轻吹打；
3.培养基组成：培养条件更换合适的血清；
4.冻存问题：使用5%DMSO的无血清冻存液冻存。
诱导因子使用问题
RANKL与M-CSF浓度不当会导致RAW264.7细胞株向破骨诱导分化出现什么问题？
答：RANKL与M-CSF浓度不当，浓度过低导致分化不全，过高引发细胞毒性。
解决方案：预实验梯度测试：RANKL推荐范围20~100 ng/mL，M-CSF 25~50 ng/mL。每48小时更换含新鲜因子的培养基，避免活性降解。
使用菩禾无需额外配置的非原代破骨诱导培养基（货号CTCC-Y005）全程提供技术支持服务。）
同一厂家同等剂量下不同批次的因子破骨诱导为什么差异会很大？
答：内毒素与杂质污染或储存与运输过程中的活性衰减都会对因子的显著活性有影响。
解决方案：1.功能性活性验证新批次因子:设置梯度浓度诱导RAW264.7细胞TRAP染色；
2.采用准化储存和使用流程:小剂量分装防止出现反复冻融影响因子活性，长期储存需-80℃；
3.使用菩禾无需额外配置的非原代破骨诱导培养基（货号CTCC-Y005）全程提供技术支持服务。）
破骨诱导问题
为什么RAW264.7细胞株向破骨诱导分化会呈现多核（≤3）但诱导无明显破骨细胞形态且trap染色不着色的现象？
答：RANK浓度过低、因子储存失效、RAW264.7细胞株初始状态差、诱导初始密度过高、初始诱导密度过低天数不达标等都会导致破骨诱导失败。（破骨白光状态例图三）
解决方案：1.及时调整RAW264.7初始状态（详见问题一细胞培养相关问题）；
2.初始诱导密度前期测试做密度梯度测试；
3.延长诱导天数且定期观察细胞形态；
4.使用菩禾非原代破骨诱导培养基套装（货号:CTCC-T001）,保证成功，不成功可退款。全程提供技术指导服务包教包会一对一教学。
为什么RAW264.7细胞株向破骨诱导分化过程中细胞株会出现漂起问题？
答：这种属于正常现象，RAW264.7细胞株增殖快且聚团生长会导致贴壁不牢。
解决方案：使用预热好的诱导液进行接种可以缓解该现象。
破骨细胞鉴定问题
为什么trap染色总是不符合我的预期会出现非破骨的情况下也着色了、破骨不着色甚至破骨着色过深这一类的问题？
答：1.染色时进行观察避免过深或过浅问题。
2.破骨形态染上色可能是在向破骨分化的早期，在分化过程中也是会与抗酒石酸酸性磷酸酶反应的（例图四）。
3. 染色节点大的破骨已经进入末期了 与抗酒石酸酸性磷酸酶反应不强烈
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师姐，我按文献步骤做了3次RAW264.7破骨诱导，每次TRAP染色都只有零星几个多核细胞…细胞传代、因子浓度都调过了，还是不行，怎么办啊…
别慌！我刚入坑时也踩过这些雷—细胞状态差、因子活性不稳、染色把握不了时机…后来用了菩禾生物破骨诱导套装，成功率直接从30%飙升到95%
果真？这套装有什么黑科技？
三大核心保障，专治各种失败：
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②傻瓜式Protocol：含细胞铺板密度、细胞株前期调整操作，诱导不同天数效果等；
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