WB小课堂 | 转膜实验中踩过的那些坑（内附小贴士）

师弟咋啦，怎么这么苦大仇深的？??

师兄，我WB（蛋白质印迹实验）的膜这次又是“白白净净”，啥也没有，连marker也没有，比我的脸还干净。??苍天啊，为什么呢？明明是按照你们之前教我的实验方案和步骤来的。??

如果是按照我们之前的方法来，应该不会有太大的问题呀，至少marker应该是能看到的。是不是转膜的时候方向错了？缓冲液放错了？

转膜需要注意方向，是从胶的方向（负极）转到膜的方向（正极），电流方向和膜胶的放置顺序不能反。如担心有错误（可以背一个口诀—膜正胶负）。

注意转膜缓冲液与电泳缓冲液不一样，转膜缓冲液也不宜放置过久时间。（时间过长，缓冲液长菌后不稳定）。

转膜的方向我核对过了，没有错误。缓冲液是新配置的，很澄清应该没有啥问题。倒是膜的话，Z近实验室刚买了新的，不知道新膜的条件和旧膜是不是不太一样？?

正常来说各大公司的膜差不多，都是一样用的。我们常用的是PVDF膜，你是不是用成NC膜啦？这两种膜都可以拿来做WB实验，不过呢NC膜结合蛋白的载量低一点，但背景干净。我们现在做化学发光＋ECL的WB实验多一些，所以常用PVDF膜结合载量高一些，背景嘛也会稍微高一些。如果你以后要做荧光标记的WB实验，就用NC更合适。不过膜材里面根据孔径大小不同，还要选不同规格。不同的膜用途除了WB还可以用于其他蛋白质印迹杂交实验：高质量的PVDF膜有些种类还能消化下来打质谱呢！还有一些NC膜可以用来检测临床检测体外诊断试剂盒。

化学发光WB使用频率PVDF＞NC，荧光标记WB使用频率NC＞PVDF。

一般膜的孔径有0.1微米、0.2微米、0.45微米。根据蛋白的分子量来选。一般10-20 kD的蛋白才用0.2及以下的。大部分的蛋白都是通用0.45微米的。

可根据不同实验需求来选择规格，如下图。

??师兄果然见多识广，太干货，我赶紧截图保留了！那这样看起来我的膜选择应该也是没有问题的，我就是用的0.45微米的PVDF膜。会不会是新膜的转膜条件没有摸索好？或者是新的膜效果没有原来另个公司的膜效果好？

??转膜条件倒也是也有可能。不同公司的制模工艺也不太一样。万一你原来使用转75 min的条件对于这类膜来说太久了转过了，那可能要优化缩短10 min就有效果了。或者这类膜的结合能力没有原来的强，那就需要增加转膜时间和电流电压了。

那要是这样，我就得重新做2块胶，再和之前的膜对比一下了。??

??是的，可能需要对比验证一下，但是别怕，师兄教你一个快速验膜技巧。首先你拿一块胶。用大孔（10孔）平行上样10个同样的内参。（目的蛋白怕是抗体问题不好验证）。平行处理上样量全部相同。然后第一孔和第五个孔加同样的marker。剪需要对比的2个膜（一新一旧）各覆盖整张膜的一半。然后直接转膜就可以啦。后面不用孵育抗体，直接转膜后用丽春红染色直接可以看转膜效果了。（如果是预标记的总蛋白，直接用荧光凝胶成像拍膜即可）！

这样既不用做完整个WB，又可以快速判断到底是不是膜的品类或者质量问题啦。

实验由于涉及多个环节，很容易有实验误差，用两块胶同时转膜验证，还是不能完全判断膜的问题（其中还涉及胶的差异，转膜操作是否有气泡，转膜覆盖是否完全贴合等问题）。

懂啦，又学到了！这个方法太好啦！?我下午就去试试！你太给力了师兄。为了表达我对你无与伦比的感谢！待会中午我请你吃肉夹馍！

小事情。不过，肉夹馍可以有！??走起，现在去吃饭。实验问题会有办法的，回来咱们慢慢解决。经验多了你就不会犯错误啦！

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