过氧化氢酶简介

　　过氧化氢酶(hydrogen peroxidase)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一。

一、过氧化氢酶的发展

　　过氧化氢酶的研究可以追溯到100多年前。

　　Z初Thenard发现了动植物组织可以分解过氧化氢，产生氧气。

　　1892年Jacobson证明了过氧化氢酶的存在。后来经过人们的不断努力，不仅考察其化学活性，而且对其活性ZX、活性基团进行深入的研究，并从牛肝中分离得到过氧化氢酶的结晶。

　　1948年Herbert和Pinsentdiyi次从藤黄微球菌中获得原核过氧化氢酶。随着研究的深入，人们获取了真核生物所产过氧化氢酶，到后来也可以从酵母中获取过氧化氢酶。目前，研究者们已筛选出越来越多产过氧化氢酶菌株。

　　1951年，Brizuela等首次报道了用杆菌Bacillus发酵生产过氧化氢酶。随后，Petruccioli等在1994年通过研究发现变幻青霉生产过氧化氢酶的强度达0.1U/(ml·h)。

　　2004年筛选出的溶壁微球菌所产过氧化氢酶酶活可达到1100U/ml。

　　到2008年，Nakayama等从枯草杆菌中获得的过氧化氢酶产量达18000U/ml，生产强度已高达1000U/(ml·h)。

　　随着菌种筛选工作的不断展开，人们对于产酶水平的要求也不断提高，但是通过筛选和培养难以获得大量且低成本的过氧化氢酶，因此采用基因工程菌来获取高产量且能满足不同应用条件的过氧化氢酶成为研究热点。

　　Furuta等在1990年首次报道了以大肠杆菌为宿主构建产过氧化氢酶的基因工程菌，基因来源是小鼠肝脏细胞，但获得的产量不高，仅为总可溶蛋白的0.1%。为了获取产酶量高的过氧化氢酶重组菌，人们开始尝试不同来源的过氧化氢酶基因和不同表达宿主。

　　1997年Nagy等将结核分枝杆菌中的过氧化氢酶基因克隆并导入大肠杆菌，所得过氧化氢酶蛋白量为总蛋白量的30%。

　　2008年又有研究者将嗜冷杆菌中的过氧化氢酶基因克隆导入到大肠杆菌中，重组菌酶活可到达11000U/ml，产率为458U/(ml·h)。

　　张兴群等发现，来源于微球菌的过氧化氢酶(CAT)比活高，因此将含微球菌过氧化氢酶基因的重组表达质粒pProExHTCAT导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌BL21(DE3)/pProExHT-CAT，并且优化其培养条件，在相同实验条件下以野生菌酶为对照，重组酶活性提高了66%。

二、过氧化氢酶的结构

　　过氧化氢酶(CAT)根据其结构的不同分为3类：典型的单功能血红素CAT(下图A)、CAT-过氧化物酶(catalase peroxidases，CAT-POD)(下图B)以及非典型的锰过氧化氢酶(manganese catalase，MnCAT)(下图C)。

　　单功能血红素CAT存在于真细菌、古细菌、原核生物、真菌、植物和动物中，尽管来源不同，但其结构具有高度相似性。CAT由4个相同肽链亚基组成，每个亚基各有一个血红素活性位点(下图A)，该血红素辅基以铁卟啉形式存在，每分子CAT含有四个铁原子，相对分子量一般为200～340Kd，四条肽链由亚基间的作用力相互缠绕，形成了CAT的特殊结构。

　　CAT-POD可以说是典型CAT的衍生物(下图B)。它主要存在于细菌、真菌和藻类，在动植物中未发现其存在，具有和典型CAT相同的催化功能，是CAT和POD产生的可逆复合体，其催化功能比典型CAT要低一个数量级，但这种差别在生物体内可以忽略不计。

　　MnCAT是一种不含血红素基，但含有锰的过氧化氢酶：锰离子替代了铁卟啉结构(下图C)。目前发现的MnCAT非常少，主要存在于一些嗜极微生物。有学者对MnCAT的活性ZX结构、催化反应机理和模型物进行了研究，该研究中提到利用电子光谱与电子自旋共振(ESR)谱Z先证实锰CAT有2个紧邻的锰离子，存在混合价态Mn2(Ⅱ，Ⅲ)和Mn2(Ⅲ，Ⅳ)。还原态Mn2(Ⅱ，Ⅱ)显示弱的反铁磁性偶合，而氧化态Mn2(Ⅲ，Ⅳ)显示较强的反铁磁性偶合。

　　三种酶虽然在结构上具有一定的差异，但是其功能都是一致的，都是通过两步氧化还原反应，将H₂O₂歧化为H₂O和O₂。其中单功能血红素CAT和CAT-POD反应时是血红素卟啉环和铁先被H₂O₂氧化，形成复合物Ⅰ，然后该氧化后的复合物Ⅰ再将另一分子H₂O₂氧化，生成原来的酶、H₂O和O。

　　三种酶的反应机制相似，底物相同，产物相同，不同之处就是MnCAT产生O₂是在diyi步反应，而单功能血红素CAT和CAT-POD是在第二步产生O₂。

三、过氧化氢酶的功能

　　过氧化氢酶(CAT)在原核生物和真核生物中普遍存在，其主要功能是能将H₂O₂分解为H₂O和O₂，而H₂O₂是一种有害的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，可以被还原为各种有害的自由基而氧化细胞中的各种成分，使细胞发生病变。因此，过氧化氢酶能够预防过量的过氧化氢对细胞产生的毒害作用，并与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)共同组成抗氧化酶系统。

　　Z近的研究表明过氧化氢酶还可以作为一种非常有用的生物标记物，检测引起水生生物氧化应激反应的污染物的含量。生物体内适量的H₂O₂可以作为第二信使参与细胞的信号转导通路，引起免疫细胞的激活、炎症反应、细胞增生、细胞衰老和细胞凋亡;相反，过量的H₂O₂能够损害生物细胞中的各种成分，如蛋白质、脂质、DNA等。

　　1、过氧化氢酶在微生物中的功能

　　在对微生物的研究中发现，CAT可以保护病原微生物免遭宿主细胞的杀伤作用而使机体患病，因此进一步研究CAT的功能可以更加深入地研究病原微生物的致病机制，进而研制出更为有效的KJ药物。作为机会致病菌的新型隐球菌，侵入宿主后可以在吞噬细胞中存活，说明该菌可以抵御宿主细胞的氧化应激反应。

　　Giles等研究了该菌的抗氧化防御机制，发现新型隐球菌的CAT基因家族有四个成员：CAT₁、CAT₂、CAT₃、CAT₄，这四种酶在抵御内在和外在的活性氧时相互协调，在不同时期，不同位置发挥抗氧化作用，以利于该菌在宿主细胞中生存。

　　Loots在研究耐药结核杆菌菌株对异烟肼抗药性时发现，该菌株的CAT-过氧化物酶基因突变时，该菌具有较高的抗药性，原因是该酶可以激活异烟肼(抗结核药)的前体药物。

　　在对酵母菌的过氧化氢酶活性的研究中Martins等发现诱导胞质中过氧化氢酶活性在保护酵母对抗外源性H₂O₂至关重要，但是当细胞处于没有营养的培养基中时该酶活性被过氧化氢所YZ。由此可以看出CAT在微生物中也有重要作用。

　　2、过氧化氢酶在植物中的功能

　　在植物中过氧化氢酶基因家族由多基因编码且该酶普遍存在于乙醛酸循环体、过氧化物酶体、叶绿体及胞质中，是清除H₂O₂的关键酶。

　　有学者研究盐穗木的耐盐机制时发现，HcCAT1基因受盐胁迫表达量上调。邢朝斌等研究CAT基因在刺五加抗逆性反应以及次生代谢反应中的作用，用实时定量PCR检测到CAT基因在不同时期不同器官的表达量，结果显示CAT基因在不同时期不同器官都有表达，其表达量呈显著差异。

　　另有研究证明，在光照、植物激素、臭氧、温度、外源物质、H₂O₂、高渗透压及重金属等逆境下，植物中的CAT表达量以及活性都有所变化，说明CAT在应对这些逆境方面起重要作用。同时，CAT在植物细胞的衰老和细胞凋亡以及植物细胞内的氧化还原平衡也具有重要作用。

　　3、过氧化氢酶在动物中的功能

　　在对动物CAT的研究发现，该酶与一些无脊椎动物的免疫防御有关。如当一些水生生物受到外界环境刺激时，会导致呼吸爆发而产生过量的ROS来抵御外界刺激。CAT就是用来去除产生这些活性氧的中间产物H₂O₂的清除剂。而且人体内的CAT也是用来减缓细胞中的应激反应，该反应与人体的防御机制、细胞凋亡、细胞衰老、炎症反应、肿瘤的形成以及基因的突变都有一定的关系。

　　有学者研究彭泽鲫鱼受重金属镉刺激后体内活性氧的产生以及抗氧化酶系统的变化时发现，在不同镉离子浓度，以及不同组织中均检测到CAT活性，而且在镉离子浓度为0.1mg/L，肝组织中该酶的活性Z强。这主要是由于在镉离子的刺激下肝内的活性氧含量升高，这也充分说明了CAT在抗氧化防御系统中的重要作用。

　　Arockiaraj等研究罗氏沼虾时，向其体内注射IHHNV(传染性皮下及造血组织坏血病毒)发现CAT在消化道、鳃、肌肉、血细胞、肝胰脏、附肢、大脑等组织中均有表达，而且在消化道中表达含量Z高。这些结果表明当宿主遭受外界刺激时，CAT也具有重要的防御作用。

四、过氧化氢酶的应用

　　1、纺织印染工艺

　　在纺织工艺中往往利用过氧化氢在高温和强碱的条件下对织物进行漂白，为后续的染色工艺做准备。漂白后进入染色步骤，染浴中如果仍存在未充分分解的过氧化氢，那么会造成漂白后对氧化剂敏感的活性染料褪色，导致染色效果不理想。所以，为了保证后续的染色工艺顺利进行，需要将漂白后残留的过氧化氢全部去除。

　　传统工艺常采用水洗或者化学还原剂去除。这不仅使得工艺程序复杂化，而且容易生成有毒和难降解的物质。因此，现今人们多采用过氧化氢酶去除残留的过氧化氢，即可达到GX、节能、环保的优势。为了提高过氧化氢酶在印染生产中的稳定性，研究者们往往对其进行固定化。

　　Opwis等以棉织物为载体制备固定化过氧化氢酶，使其耐酸碱性、热稳定性和贮藏稳定性显著提高。而Costa等利用无机材质氧化铝经过戊二醛交联固定化过氧化氢酶，以此处理氧漂废水，并且回收用于染色加工。

　　2、食品

　　现今过氧化氢被应用于奶酪、牛奶、鸡蛋和乳清等食品的杀菌，同时人们也开始利用过氧化氢酶去除食品中残留的过氧化氢。这一方法相较于物理或者化学法而言，能够节约成本且达到环保、GX的目的。

　　为了减少过氧化氢对奶制品质量造成的不利影响，可将食品在65℃以下短暂暴露于过氧化氢中，后续加入过氧化氢酶进行处理。在保存牛奶的过程中，过氧化氢酶还可作为乳过氧化物酶和过氧化氢-硫氰酸盐体系中的成分，在较低浓度过氧化氢的存在下，提高牛奶的KJ能力。

　　Leman将过氧化氢酶固定在DEAE-纤维素上，并用己二胺和戊二醛对其进行修饰，将100mg制备的固定化过氧化氢酶铺设在流式反应床上，可以处理57L过氧化氢浓度为0.036%的高温牛奶。该方法处理效果良好，达到了牛奶饮用标准。

　　3、酶生物传感器

　　在生物传感器领域研究Z早、应用Z多的为酶电极。这主要是酶电极具有设备简单、成本低廉、灵敏度高等特点。

　　过氧化氢酶是酶电极中Z常用酶制剂之一。将过氧化氢酶固定在电极表面，在电子受体过氧化氢的作用下，被氧化的反应物在电极上电化学还原，其还原电流与反应物的浓度呈正比。此外，过氧化氢酶作为一种血红素蛋白，直接电化学也为研究酶电极的氧化还原转换机制提供了一个模型。

　　有学者将过氧化氢酶通过二氧化硅溶胶凝胶膜固定在电极表面，固定化酶后酶电极表现出对过氧化氢良好的检测性能。

　　4、工业酶催化体系

　　在很多工业酶催化过程中会产生过氧化氢，而过氧化氢的存在往往会影响酶催化过程的顺利进行，所以需要加入过氧化氢酶将产生的过氧化氢分解。

　　例如，葡萄糖氧化酶作为一种糖蛋白能够氧化β-D-葡萄糖，并生成葡萄糖酸和过氧化氢，而大量的过氧化氢会YZ葡萄糖氧化酶的活性，从而影响反应的顺利进行。如果在体系中加入过氧化氢酶，则可将过氧化氢分解，保障反应的连续、顺利进行。

　　有学者将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行分次固定，并且对固定化条件进行了优化。该验结果说明，所制备的固定化酶具有良好的操作稳定性，连续反应10批后相对酶活仍为85.3%。

五、展望

　　由于过氧化氢酶来源广泛且催化性能较高，相关的研究和应用一直是人们关注的热点。现今过氧化氢酶的固定化和应用已取得很大进展，相比较游离过氧化氢酶而言，固定化酶能被更加有效地被利用到各个领域中。

　　因此，今后过氧化氢酶的研究工作应该侧重于改进传统固定化方法，开发更多环保、节约、有效的固定化方法;利用极端过氧化氢酶的特点，进行极端条件下的固定化，制备出性能更加优良的固定化酶。由此可见，随着现代技术的不断发展，固定化过氧化氢酶在各个领域的应用范围必将不断扩大。