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荧光定量PCR检测方法

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将荧光基团加入到PCR反应体系中,通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现,再根据标准曲线定量分析未知模板的方法,即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中,实时检测全程PCR扩增过程,按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。


三个阶段

1.荧光背景信号阶段

在该阶段,不能区分背景和扩增的荧光信号,不能对产物量的变化进行判断。


2.荧光信号指数扩增阶段

PCR产物量的对数值和起始模板量的线性关系仅仅在荧光累积进入指数阶段才存在,因此,在PCR反应在指数阶段来对PCR产物的量进行检测,通过此将模板最初的含量推断出从而进行定量分析。由研究可知,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越少,则Ct值越大。由已知起始拷贝数的标准品能够将标准曲线获得,仅需将未知样品的Ct值得到,就能够根据标准曲线将该样品的起始拷贝数计算出来。


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3.平台期

在平台期,扩增产物指数级的增加不再存在,因此反应终产物量与起始模板量之间也不存在。起始DNA拷贝数也不能够根据反应终产物计算出来。


检测方法

1.TaqMan探针法

当探针完整时,淬灭基团吸收报告基团发射的荧光信号。PCR扩增时,探针在Taq酶的5’-3’外切酶活性作用下酶切降解,分离开了淬灭荧光基团和荧光基团,从而使荧光信号能够被荧光监测系统接收到。也就是每有一条DNA链扩增,就会形成一个荧光分子,使PCR产物的形成与荧光信号的累积的完全同步实现。


2.SYBRGreenⅠ法

在PCR反应体系中,将过量SYBR荧光染料加入,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,将荧光信号发射出来,而不掺入链中的SYBR染料分子不会有任何荧光信号发射出来,从而使PCR产物的增加和荧光信号的增加得到保证。


2019-07-11 17:02:13 浏览次数:75次
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