液相色谱分离技术

液相色谱是以液体为流动相，能溶于水或有机溶剂的各种物质为分析对象的色谱分析方法。色谱是不同颜色的光通过棱镜折射后所形成的一系列谱线。液相色谱可以有薄板、纸和填充床等不同的固定相，因此又有薄层色谱、纸色谱、柱液色谱之分。

经典液相色谱法分离原理、特点

由于流动相分子与各组分争夺吸附剂表面活性ZX，利用吸附剂表面的活性吸附ZX对不同组分的吸附能力差异而实现分离。

经典液相色谱的流动相流过色谱柱是靠的重力，因此不可能是太小粒度的固定相(100μm～150μm左右)。分离后的样品是被分级收集后再进行分析的，使得经典液相色谱不仅且操作也比较复杂，而分离效率低、分析速度慢。

在20世纪60年代开始，粒度小于10μm的GX固定相被开发出来，并使用了高压输液泵和自动记录的检测器，克服了经典液相色谱的缺点，发才展出GX液相色谱，也称为高压液相色谱。

液相色谱的类型

液相色谱可以有不同的分离原理，按原理不同液相色谱可分为离子交换、吸附、凝胶、分配四种类型。

液相色谱分类

离子交换色谱

离子交换色谱是让固定相离子与样品离子进行可逆交换，利用各组分离子的交换能力不同，实现色谱的分离目的。离子交换色谱的固定相通常采用离子交换树脂。

离子交换色谱法是一种新兴分离技术，常被用于蛋白质和氨基酸的分析，也适合于某些无机离子(NO3-、SO42-、Cl-等无机阴离子和Ca2+、Na+、Mg2+、K+等无机阳离子)的分离和分析，有很重要的作用。

吸附色谱法

因为固定相为吸附剂，吸附色谱法在吸附剂表面实现分离过程，不进入固定相的内部。与气相色谱不同，吸附色谱的流动相(即溶剂)分子也与吸附剂表面发生吸附作用。在吸附剂表面，样品分子与流动相分子进行吸附竞争，因此流动相的选择对分离效果有很大的影响，一般可采用梯度淋洗法来提高色谱分离效率。

在进行聚合物分析时，吸附色谱一般用来分离添加剂，如抗氧化剂、偶氮染料、表面活性剂等，也可用于石油烃类的组成分析。

凝胶色谱法

凝胶色谱法又叫分子排阻色谱法，是一种快速而又简单的分离技术，可以不需要有机溶剂，尤其能够GX地分离高分子物质。凝胶色谱法可适用于水溶液的体系，又适用于有机溶剂的体系。当所用的洗脱剂为水溶液时，称为凝胶过滤色谱，其在生物界的应用比较多；采用有机溶剂为洗脱剂时，称为凝胶渗透色谱，在高分子领域应用较多。

分配色谱法

分配色谱的固定相和流动相都是液体，利用液体固定相对试样中诸组分的溶解能力不同，即试样中诸组分在流动相与固定相中分配系数的差异，而实现试样中诸组分分离的色谱法。

目前，分配色谱应用较多的是键合固定相。在这种固体相中，固定液不是涂在载体表面，而是通过化学反应在纯硅胶颗粒表面键合上某种有机基团。一般常用的固定液有β，β'-氧二bing腈(ODPN)、聚乙二醇(PEG400～4000)、三甲撑乙二醇(TMG)和角鲨烷(SQ)。采用与气相色谱(GC)同样的方法，将固定液涂渍在多孔的载体表面，但在使用中固定液易流失。

与气相色谱异同

在色谱分离度、保留值、塔板数、塔板高度、选择性、塔板理论与速率方程等基本概念和理论等与气相色谱一致

液相色谱的液体流动相和气象色谱以气体为流动相不同外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定的差别。

液相和气相色谱的不同之处有以下几个方面：

①液相色谱可以用于高难度分离

a.液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时，选择余地大；而气相色谱并不可能。

b.气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，基本不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子主要与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选择不同比例的两种或两种以上的液体做流动相，增加分离的选择性。

c.液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。

②操作条件及应用范围不同

因是加温操作，气相色谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质，对非挥发性物质、高沸点化合物、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难，致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的机物能用气相色谱分析。而液相色谱是常温操作，不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合相对分子量较大，难汽化，不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析，大约占有机物的70%~80%。

③由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，由色谱柱外区域引起的扩张可以忽略不计。

④由于液相色谱中制备样品简单，而且能够轻松的定量回收样品，适合于大量制备，但液相色谱尚缺乏通用的检测器，一起比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种技术是相互补充的。

结合以上分析可知，液相色谱具有分析速度快、柱效高、灵敏性高、选择性高、应用范围广等优点，已成为现代分析技术的主要手段之一。液相色谱在化学、生化、医药、化工、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。

液相色谱仪

液相色谱仪就是基于液相色谱法，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。其利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定。

相色谱仪根据固定相是液体或是固体，又分为液-液色谱(LLC）及液-固色谱(LSC）。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较，具有GX、快速、灵敏等特点。

液相色谱仪组成和分离过程

系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来GX液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，

GX液相色谱和反相GX液相色谱

GX液相色谱

GX液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀。因为较小的填充颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。

GX液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和GX微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

使用GX液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，Z后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。GX液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛地应用于化学和生化分析中。

反相GX液相色谱

反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物，大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。反相GX液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的Z主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。

而反相键合相色谱法中使用的非极性键合固定相，是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链(c4、C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在GX液相色谱中又被称为疏溶剂作用。