用hap纯化的引物可以进行实时定量pcr吗

导读

说起引物，大家都再熟悉不过了。引物，在核苷酸聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。无论是做普通PCR还是荧光定量PCR，设计合适的引物是非常关键的一步。

普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量，普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面，有什么相同点和不同点呢？今天小编就给大家汇总一下。

相同处：

▶  序列的查找是一致的。

▶  序列选取应在基因的保守区段。

▶  选取合适的扩增片段大小。

▶  避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对。

▶  避免引物自身形成环状发卡结构。

▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。

▶  引物之间的Tm相差避免超过2℃。

▶  引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

不同处：

荧光定量PCR 引物

▶  PCR产物长度：要求在300bp以内，一般选80-150bp之间。

▶  引物特异性：对引物要求高，尽量减少引物二聚体的产生，熔解曲线要求单一产物。

▶  扩增效率：荧光定量 PCR的目的是进行定量或者相对定量，扩增效率应在90%—110%之间。

▶  多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物。

▶  目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物。

普通PCR 引物

▶  普通PCR的扩增长度，根据实验的要求不同，一般是从150bp到几千bp不等。

▶  相对于荧光定量PCR，普通PCR对二级结构要求较低。

▶  对扩增效率要求不高。

▶  可以选用梯度PCR仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致。

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