如何鉴定DNA提取磁珠？

基于SPRI技术的AMPure XP，采用超顺磁磁珠帮助纯化核酸片段，被广泛应用到NGS行业，PCR体系、酶切、连接反应体系的纯化。作为行业的“金标准“试剂盒，AMPure XP有哪些高频Q&A问题呢？

AMPure XP怎么纯化长片段？

怎么提高我的样本得率？

产物纯度有什么优化的方向吗？

我可以选择纯化250 bp的那一条条带吗？

小贝总结了10条AMPure XP Q&A问题实用技巧：

1、乙醇比例

乙醇溶液必须至少70%。当将100%乙醇稀释至70%时，请确保在配置溶液合并之前分别测量水和乙醇的体积。用水补齐乙醇的稀释方式会导致浓度低于预期。请确保存储的乙醇在不使用时保持瓶盖拧紧。

2、充分的混合

在最 初磁珠与样品结合和洗脱混合期间，彻底的混合至关重要。可用略低于总孔体积的吸头进行混合。洗脱时，需要注意最 小洗脱体积（96孔规格为40 μL，384孔规格为15 μL），以确保磁珠充分重悬。还应保持足够的孵育时间，以确保核酸有足够的时间与磁珠结合或解离。由于样品的粘度，结合过程中的涡旋可能效率不高。

3、大反应体系

大体积反应可以采用更长的样品&磁珠结合和磁分离时间。可将binding结合时间增加到10分钟，并确保在弃上清液之前所有的磁珠均被充分磁分离。

4、避免实验中磁珠损失

如果在弃清液的过程中磁珠被吸入枪头，结合在这些磁珠上的核酸则会在这个步骤损失掉。首轮移除上清时，缓慢轻柔地操作，尽可能多地移除清液，同时确保不会干扰磁珠在磁环/磁力架上的吸附。如果意外吸出磁珠，请将所有磁珠重新打回孔中，让磁珠重新磁吸。随后，再度移除上清，尝试缓慢吸液或使用更细的枪头。小体积样品更容易受到磁珠损耗的影响，因为磁珠可能达不到孔中磁铁的水平位置。

5、大片段样品的磁珠干燥

10 kb以上的片段与磁珠结合非常紧密，如果样品变干则难以洗脱。尽可能完全地弃掉最 后一次乙醇清洗液，立即加入洗脱缓冲液并充分混合。保持盖子打开状态，乙醇在洗脱孵育期间将继续从孔中蒸发。

6、低洗脱体积

洗脱体积小会导致回收率降低。这是因为会有少量洗脱缓冲液始终包覆在磁珠上。该体积取决于孔的形状和孔中的磁珠量，因此较小的洗脱体积将导致相对较高比例的洗脱液残留。

7、当你用紫外吸收法检测回收率

不只是PCR双链产物，体系中过量的引物和核苷酸同样产生吸收。因此测量未纯化的PCR反应，可能获得高于实际PCR产物浓度的吸光度值。对比纯化前后的吸收值，则会导致回收率看起来比实际低。小贝建议：在琼脂糖凝胶上运行等量的未纯化PCR反应产物与纯化后的PCR反应产物（例如1/4的未纯化PCR产物和1/4的洗脱液）以便检查回收情况，或使用基于特异性荧光染料的测定，例如PicoGreen。

8、引物的残留

AMPure XP试剂与PCR反应混合后的试剂最 终浓度决定了PCR产物与磁珠结合的片段大小。AMPure XP主要结合> 100 bp的PCR产物，并丢弃小于50个碱基的引物。较大的引物和引物二聚体可以与磁珠结合。请确保您的PCR产物在循环过程中没有蒸发导致体积变小，并添加正确体积的试剂（见下表）。确保用乙醇冲洗在混合和结合过程中样品有接触到孔内壁的任何地方。如果在纯化体系中存在过量的引物，减少该PCR反应的引物量也可以是一个优化的方向。

9、下游酶反应效果不佳

如果您的下游酶反应对痕量乙醇极其敏感，请添加两分钟的保守干燥步骤。请注意，大片段会与磁珠紧密结合，在磁珠完全干燥后可能难以洗脱。

10、如何选择性保留200-500 bp核酸片段

AMPure XP是用于PCR产物纯化的试剂盒。对于片段筛选的应用，请考虑使用 SPRIselect试剂盒。

有关 SPRIselect 片筛的更多信息，请访问经典磁珠一文解读:NGS片段筛选比例计算