Biochrom30+氨基酸分析仪检测海鲈鱼中水解氨基酸

摘要：

       以海鲈鱼为原料，使用Biochrom30+全自动氨基酸自动分析仪对其肌肉的氨基酸组成进行分析。结果表明海鲈鱼肌肉中氨基酸总量的质量百分比为20610.288mg/100g，必需氨基酸(不含色氨酸)占氨基酸总量的40.49%，鲜味氨基酸占氨基酸总量的38.63%。

一、样品前处理

       1、所用试剂

       1.1  浓盐酸，浓度≥36%,优级纯

       1.2 6mol/L 盐酸：取500mL 盐酸加水稀释至1000mL,混匀。

       1.3  水：去离子水

       1.4   苯酚：须重蒸

       1.5  17种氨基酸标准品

       2、前处理设备

       1)分析天平:感量分别为 0.0001g和0.00001g

       2)水解管:耐压螺盖玻璃试管,体积为25mL

       3)匀浆机

       4)无油真空泵

       5)干浴水解浓缩仪

       6)移液管

       7)0.22um滤膜

       3、样品制备（参考国标GB 5009.124-2016）

       原料鱼手工去除鱼鳞、鱼皮、鱼刺和内脏，采肉后清洗、沥干，在匀浆机中打成肉糜，于-18℃冰箱中冷冻保存，分析时取出解冻后使用。

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

       氨基酸分析仪分析方法参数：

       1)色谱柱：Biochrom Na型阳离子交换树脂柱，4.6x20cm

       2)分离程序：

       附、图谱及做样结果

一、样品前处理

1、所用试剂

1.1  浓盐酸，优级纯

1.2  6mol/L 盐酸：浓盐酸与水1:1混合

1.3  水：去离子水

1.4  苯酚：须重蒸

1.5  19种氨基酸标准品

2、标样配置

氨基酸混合标准储备液：含有天冬氨酸、苏氨酸等17种常见组成蛋白质的氨基酸。

牛磺酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

正亮氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

璜基丙氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

蛋氨酸砜标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

羟脯氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

鸟氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。

将17种氨基酸混合标准储备液、牛磺酸、正亮氨酸、璜基丙氨酸、蛋氨酸砜、羟脯氨酸、鸟氨酸及PH2.2的柠檬酸缓冲液按照1:1:1:1:1:1:1:3配置成0.25umol/L的标准品待用。

3、前处理设备

1)     天平    

2)     水解管    

3)     量筒    

4)     无油真空泵    

5)     干浴水解、浓缩仪    

6)     移液管    

7)     0.45um滤膜    

4、样品制备（参考欧盟饲料指令98/64/EC ）

1)样品的准备

粉碎样品，通过0.5mm的筛孔。高水分的样品粉碎前必须低于50℃鼓风干燥或者冷冻干燥。高脂肪含量的样品粉碎前必须用轻质石油（3.12）脱脂。

2) 氧化

从准备好的样品中称取约0.1~1克样品，准确到0.2mg，于100 ml带螺纹盖子的瓶子中，称取的样品应该含有大约10mg氮，水分不能超过100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃，加5ml氧化试剂（过甲酸苯酚），用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封，密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中，放置16小时。之后，从冰箱中取出，加0.84克偏重亚硫酸钠（3.4）来分解过量的氧化试剂。

3）水解

加入25毫升盐酸-苯酚溶液, 然后将反应瓶放在烘箱中，温度控制在110摄氏度，旋松帽子（防止玻璃瓶子破裂），水解1小时。然后快速旋紧瓶塞（戴手套和护眼罩）将其继续在烘箱110摄氏度下水解23小时。

4)加入内标并且调节pH值到2.20

当水解反应结束后，将反应瓶从烘箱中取出，并且打开瓶口（戴手套和护目镜）。冷却后用定量加样器准确加入15.00克(15毫升)正亮氨酸标准溶液，混合并且转移水解溶液到250毫升的塑料烧杯中。加入大约125毫升柠檬酸缓冲液和19毫升氢氧化钠水溶液,将实验烧杯放入到样品容器中用氢氧化钠水溶液将溶液调节到pH为正好2.20。转移一部分溶液（不需要全部）到50毫升有盖子的塑料瓶中。可以马上测定或者放入冰箱等到分析的时候测定。

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析仪分析方法参数：

1)  色谱柱：Biochrom Na型阳离子交换树脂柱，4.6X20cm

2)  分离程序：

3)     运行时间：分析时间65min

4)     反应单元温度：135°C。

5)     检测波长：570nm、440nm同时检测。

附、鱼料分析图谱及做样结果

一、样品前处理

1、              所用试剂

必须使用重蒸馏水或与之等质的水（电导率＜10μs）

1、1            双氧水,30%

1、2            甲酸，98-100%

1、3            苯酚：须重蒸

1、4            偏重亚硫酸钠

1、5            氢氧化钠

1、6            盐酸，ρ＝1.18g/ml

1、7            水解剂：6mol/l 的HCL，1L含1g苯酚：

加1g苯酚（3.3）到492mL盐酸(3.7)中，然后用水定容至1L

1、8            20种氨基酸标准品

2、              标样配置

   氨基酸混合标准储备液：称取上述各氨基酸标样使用PH2.2的Load Buffer配置成2.5umol/L的储备液备用。

  取氨基酸混合标准储备液与PH2.2的Load Buffer以1:9的比例配置成0.25umol/L的标准液。

3、              前处理设备

1)        天平

2)        水解管

3)        量筒

4)        无油真空泵

5)        干浴水解、浓缩仪

6)        移液管

7)        0.45um滤膜

4、                 样品制备（参考欧盟饲料指令98/64/EC ）

1、              样品的准备

粉碎样品，通过0.5mm的筛孔。高水分的样品粉碎前必须低于50℃鼓风干燥或者冷冻干燥。高脂肪含量的样品粉碎前必须用轻质石油（3.12）脱脂。

2、              氧化

从准备好的样品中称取约0.1~1克样品，准确到0.2mg，于100 ml带螺纹盖子的瓶子中，称取的样品应该含有大约10mg氮，水分不能超过100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃，加5ml氧化试剂（过甲酸苯酚），用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封，密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中，放置16小时。之后，从冰箱中取出，加0.84克偏重亚硫酸钠（3.4）来分解过量的氧化试剂。

3、              水解

 加入25毫升盐酸-苯酚溶液, 然后将反应瓶放在烘箱中，温度控制在110摄氏度，旋松帽子（防止玻璃瓶子破裂），水解1小时。然后快速旋紧瓶塞（戴手套和护眼罩）将其继续在烘箱110摄氏度下水解23小时。

4、              加入内标并且调节pH值到2.20

    当水解反应结束后，将反应瓶从烘箱中取出，并且打开瓶口（戴手套和护目镜）。冷却后用定量加样器准确加入15.00克(15毫升)正亮氨酸标准溶液，混合并且转移水解溶液到250毫升的塑料烧杯中。加入大约125毫升柠檬酸缓冲液和19毫升氢氧化钠水溶液,将实验烧杯放入到样品容器中用氢氧化钠水溶液将溶液调节到pH为正好2.20。

转移一部分溶液（不需要全部）到50毫升有盖子的塑料瓶中。可以马上测定或者放入冰箱等到分析的时候测定。

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析仪分析方法参数：

1)        色谱柱：Biochrom Na型阳离子交换树脂柱，4.6´20cm

2)        分离程序：

3)        运行时间：分析时间65min

4)        反应单元温度：135°C。

5)        检测波长：570nm、440nm同时检测。

三、外标法定量

附、小鸡配合饲料分析图谱

氨基酸分析仪新建序列修改

氨基酸分析仪是一种重要的实验室设备，用于检测和分析样品中的氨基酸组成。随着生物技术的飞速发展，分析仪的应用范围不断扩大，操作功能也越来越强大。在使用氨基酸分析仪时，研究人员有时需要对其预设的检测序列进行新建或修改，以满足具体实验需求。

为什么需要新建或修改序列？

氨基酸分析仪通常配有预设的序列，能够满足大多数常规样品的分析需求。某些特定的实验或复杂样品可能需要不同的检测时间、流速、洗脱剂等参数调整，预设的序列并不能完全满足这些需求。此时，研究人员需要新建或修改分析序列，以确保结果的准确性和实验的可重复性。

例如，当分析特殊的蛋白质片段、天然产物或其他复杂样本时，氨基酸的分离和检测需要更为细致的控制。而通过新建或修改序列，用户可以根据样本的特性，设置的检测条件，避免数据的偏差或不准确。

如何进行新建序列的步骤

1. 参数设置

新建序列的步是根据样本特性设定关键参数。这包括氨基酸的分离条件、洗脱剂的使用、柱温以及流速等。通常情况下，不同的氨基酸需要不同的流速和梯度条件才能实现分离。

2. 梯度程序的编写

在氨基酸分析中，梯度洗脱法通常用于提高分离效果。新建序列时，用户可以自定义梯度程序，通过设置洗脱剂的比例变化、流速的调整、时间段的划分等，来实现不同氨基酸的有效分离。确保梯度程序的稳定性和可控性，是获得高质量分析结果的关键。

3. 检测顺序的安排

新建序列时，用户可以根据分析需求调整检测顺序，以优化时间和效率。合理的检测顺序不仅能减少样品损耗，还能提高仪器的使用效率。例如，将容易分离的氨基酸安排在前，减少检测时间；而对于难分离的氨基酸，可以适当延长检测时间，提高分离度和检测精度。

修改序列时的注意事项

1. 保持序列的逻辑一致性

修改序列时，必须确保所做的调整与整体分析流程相符。例如，在改变洗脱剂梯度时，必须考虑到检测顺序的影响，避免氨基酸出现重叠或分离不完全的问题。

2. 记录和保存修改内容

在分析仪中进行任何序列的修改后，务必将新的序列保存并详细记录，以便将来参考或重复实验。通常情况下，分析仪会提供多个保存通道，允许用户保存不同的序列版本，这有助于避免数据丢失或重复操作。

3. 定期校验和维护仪器

修改序列后，建议进行一次仪器校验，确保新建或修改的序列在仪器上能够正常运行。仪器的状态和维护情况也会直接影响分析结果的准确性，因此定期的维护和校准十分必要。