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ELISA实验质量控制问题
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ELISA实验质量控制问题
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ELISA实验质量控制问题- ELISA实验质量控制问题[详细]
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2024-09-18 18:09
其它
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- ELISA实验原理、步骤、问题分析
- 上海恒远生物科技有限公司专业供应各种属elisa试剂盒，提供免费代测服务，保证实验结果客观真实性。我公司对试剂盒质量1**%保证，若存在质量问题，我们无条件包退换。若需要了解试剂盒的详细信息，请来的咨询：电话：021-6052049813636351217业务QQ:1005074258何经理ELISA实验原理、步骤、ELISA问题分析ELISA实验原理酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度类型及步骤ELISA的主要常用类型及步骤1.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（二抗）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色。2.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原Z常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。3.双抗原夹心法测抗体反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体4.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，Z后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。ELISAQ&A如何选择合适的阳性对照?阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致，一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，加入一定量的待检物质。比如，以人血清为标本的测定，阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。如何选择合适的阴性对照?阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致，**先行检测确定其中不含待检物质。比如，检测人血清标本时，阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时，阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。如何选择Zyou化的包被条件?1.包被抗原的选择包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被（先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化）。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。2.包被液的选择一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。3.包被温度的选择通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。4.包被浓度的选择包被的Z适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的Z适包被浓度需要通过实验来确定。包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以试剂盒中较少使用。如何正确使用酶结合物?1.酶结合物的稀释液在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%BSA或5%脱脂奶粉），通过竞争YZ酶结合物在固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够YZ蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20（0.05%的浓度较为适宜）。2.正确稀释酶结合物酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定，浓度过高易导致本底偏高，浓度过低则会导致阳性信号的减弱。酶结合物**在使用前稀释，稀释后的酶结合物不宜长期保存，因为低浓度的酶结合物极易失活。问题可能的原因解决方法阴性对照产生了阳性的结果试剂或者耗材污染更换试剂，使用一次性耗材洗板出现问题更换更强配方的洗涤液，增加洗板次数，延长洗板时间如果是在双抗体夹心法中出现，有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应更换包被抗体或二抗使用了过多的抗体减少抗体使用量整板出现高背景二抗产生了非特异性吸附减少二抗使用量，缩短二抗反应时间显色液不新鲜使用现配的显色液显色反应时间过长没有终止控制显色反应时间，及时终止反应试剂或者耗材污染更换试剂，使用一次性耗材反应温度过高导致的非特异性吸附严格控制反应在Z适温度下进行封闭条件不佳导致的非特异性吸附更换封闭能力更强的封闭液，延长封闭时间反应信号偏低包被条件不合适提高包板浓度，延长包板时间抗原抗体反应不够充分延长反应时间，确保反应在Z适温度下进行显色液配方不恰当增加显色底物的量二抗结合不够提高二抗浓度，延长反应时间，更换效果更好的二抗梯度稀释做ELISA时产生跳孔现象酶标板叠放导致传热不均匀，各孔反应温度有差异尽量避免酶标板叠放在一起移液器稀释时未能保持连续性定期校准移液器，确保移液器的正确使用反应溶液蒸发酶标板用封条密封或者加盖洗板不均匀确定洗板机能够正常工作酶标板底有杂物或者水珠读板时清理干净酶标板底部[详细]
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2018-11-16 10:02
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GJB 5915-2006 塑料制品质量控制- GJB 5915-2006 塑料制品质量控制[详细]
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2014-09-05 00:00
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- 检测结果的质量控制
- 迈科诺（MKN）：勇迈高峰、科技为本、一诺千金！ 迈科诺仪器有限公司，是一家集设计研发、生产销售和服务为一体的高科技型企业，企业严格执行ISO9001及ISO14001质量管理体系要求，专注生产销售“迈科诺”及“MKN”品牌实验仪器、科教仪器、分析环保仪器等百余种产品，产品全国各大、中院校、卫生、防疫、化工、环保等科研单位。我们是一个勇于创新且持续改进的团队。以顾客需求为导向，服务顾客为己任，彰显迈科诺（MKN）仪器的核心价值。 勇迈高峰：团队协作，相互沟通让企业迈向新的高峰。 科技为本：全速创新，立于科技让企业发展同步于世界。 一诺千金：客户承诺，用心服务于客户让我们更值得信赖。主营产品：低温恒温槽，低温冷却循环泵，低温恒温反应浴、恒温油槽，恒温水槽，水浴锅，气浴恒温振荡器，水浴恒温振荡器，普通振荡器，血液溶浆仪，摇瓶机，摇床，蒸馏水器，电热板，超声波清洗器，培养箱，干燥箱/烘箱，生化培养箱，霉菌培养箱，人工气候箱，恒温恒湿箱，光照培养箱，离心机，电动/磁力搅拌器、粉碎机，匀浆机。[详细]
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2018-08-22 10:00
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- 【干货】磨粉机的质量控制
- 磨粉机的主要功能磨粉机的功能或作用，就是粉碎小麦，造渣、出粉、提麸（或造麸）。小麦制粉是个复杂的过程，在不同工艺部位的磨粉机各自的作用是不同的。磨粉机的功能必须按照工艺设计的要求，该出粉部位的磨粉机出粉，该出渣部位的磨粉机出渣。根据不同工艺要求，磨粉机分成了皮磨、心磨、渣磨和尾磨。机械设计工程师根据不同的工艺要求对不同部位的磨粉机设计了各不相同的技术参数和不同性状的零部件，使得磨粉机可以满足不同部位制粉工艺研磨效果的具体要求。磨粉机质量优劣的衡量标准简单一句话：能够充分满足制粉工艺设计要求的磨粉机就是好磨粉机，就是高质量的磨粉机。从机械设计和制造的角度上讲，如何能满足工艺设计上的要求呢？磨粉机必须满足下面三项。①喂料必须均匀。②轧距必须稳定可控。磨粉机轧距稳定有两层意思。一是轧距调节灵活，二是调节好的轧距能够始终保持如初。我们虽然要求喂料均匀，但能够真正做到喂料均匀是不可能的，即使机械上没问题，工艺流程中也不可能物料始终一致，因此料流大小变化是常事。这就要求，磨粉机轧距调节好后，不能因物料多少变化而轧距变化。③控制系统灵敏可靠。磨粉机质量控制1）保证喂料均匀①进料斗足够大。磨粉机进料斗，俗称观察筒，一般采用不锈钢制造，用于观察储存物料。足够大，可以防止料流的波动，起缓冲的作用，使进料斗流出的物料是均匀的。②喂料挡板密封可靠。喂料挡板是在进料斗下方与喂料门接触，可以转动的一块活动板，伺服于喂料门的运动，下边沿与喂料门始终紧贴在一起，上边沿通过机械结构铰接于磨顶下部。物料只能从喂料门与喂料辊之间缝隙均匀流出，否则会影响喂料效果，进而影响研磨效果。喂料不均匀一般就是这部位容易出问题。如侧方漏料，表面看是侧方漏料，其实是两个原因造成的不同问题。一是确实是喂料挡板两边密封效果不好，从喂料挡板与磨粉机侧板间隙漏出细小物料，在喂料辊两端形成略厚于其他部位的料流层。另一个问题，在心、渣、尾磨前后喂料辊之间安装了溜料板，由于溜料板是固定在磨粉机侧板上的，固定溜料板的那块固定板本身是有厚度的，当物料沿着磨粉机侧板流下来时，遇到固定板，料流就会产生集中，形成一小股“躲"过固定板流下来。可别小看这一小股，这一小股流到磨辊上如果分散开了，影响并不严重，如果分散不开出现在磨辊上，那后果是很严重的。设计和加工时必须注意到上述问题，采用合理的方法加以解决，保证流入到轧距处的物料是均匀的。一般解决方法：提料板加工精度，采用合理的密封手段；改变溜料板的固定方法，就是不让溜料板的安装阻碍物料流动。③合理设计喂料辊表面性状。喂料辊表面性状制造厂家大都已经解决，但细节上需要注意。一般喂料辊都区分为一皮，粗皮和细皮，而心磨、尾磨和渣磨一致。近几年各厂家根据自己经验做了很多改进，效果越来越好。磨辊间轧距稳定的保证保证磨粉机轧距稳定性的主要措施：一是结构设计，二是材料选择，三是加工精度。①结构设计是基础。磨粉机轧距结构设计**的，我个人认为当然是布勒公司的MDDK，早在2003年，布勒公司申屠明亮工程师就撰文阐述过这一点。笔者又先后三次撰文介绍了这一结构的优点，并从理论上做了详细的解释和阐述。设计磨粉机的技术人员很有必要认真研究有关资料文献，首先从结构设计上使国产磨粉机达到国际水准。②材料选择是保证。材料是指磨粉机上与轧距有关的所有零部件材料，其强度和刚度一定要保证。特别是刚度，就是零部件受力条件下的变形量，研磨效果要稳定，关键零部件的刚度必须保证，变形量一定要小，否则很难保证好的研磨效果。这部分零部件材料基本分三类，一类材料是铸件，即灰铸铁件，牌号控制在标准HT200~250之间；第二类材料是铸钢件，基本是ZG270~500，也就是过去的老标准ZG35~40；第三类材料是杆轴类零件，材料用65#钢或40Cr。这部分零件在磨粉机整机中从重量上来说，所占比重不大，但对磨粉机来说是非常重要的，因此我们从材料选择上讲，是宁好勿次，宁高勿低。选高选好，整机成本增加不了多少，但对于整机质量而言却是至关重要的。几何尺寸上讲，只要空间位置允许，尽可能选择大一些，安全系数大些。这一设计理念一定要重视，特别是对磨粉机的设计上，尤为重要。另外还要重视合金类材料的选择使用。在转动部位，在精度要求较高的部位合理设计轴、套类零件，有利于降低制造成本和保证制造精度，且延长相关零部件的使用寿命，更换零部件更方便。③加工精度是关键。目前加工手段技术上和装备上基本没什么问题，我国制造磨粉机的企业，数控机床，激光切割，各类磨床等加工设备和加工手段都有保证。关键是我们管理人员的重视程度和工人技师的操作水平，Z关键还是的认知水平，其直接影响磨粉机制造精度。外形和几何尺寸基本能满足要求和容易控制，关键点是零部件表面加工光洁度（或说粗糙度）必须保证。一定要严格要求和控制接触类零部件之间的表面光洁度要求。设计再好，材料再好，加工上粗制滥造，同样不会制造出好产品。我们的机械设备使用初期与国外设备差距不大，但使用一段时间就暴露出问题了，越来越不好用，精度达不到了，故障率高了，这很大程度上都是这些机械零部件的粗制滥造，细节上注意不够，精度达不到要求，一磨合问题就出来了。控制系统质量保证控制系统主要是电器系统、气动系统、电子控制部分。这部分设计要求管线合理布置，元部件质量有保证，没有程序的逻辑错误。这部分可以说是磨粉机的神经和大脑。要想控制灵敏可靠，其中自然要包括机械结构零部件功能的可靠。需要转动的零部件转动必须灵活，需要固定的零部件固定必须可靠。机械加工精度问题无疑是很关键的一环。磨粉机具有零部件多，机械结构复杂，涵盖知识面广，各系统的协调配合是很关键的。喂料均匀和启停及时，轧距大小调节和离合动作灵敏，喂料自动的灵活与否，轧距稳定与否，这些都涉及到机械加工的精度问题。要求精度高的部位零件一定要精工细作。特别是喂料部位和轧距系统结构部位精度要求高，一定要按照液压元件或气动元件的加工精度来要求。[详细]
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2018-11-17 10:00
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