省时省力, 二维液相分析配方奶粉中的维生素A D E

配方乳——脂溶性维生素

维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一种微量有机物质，根据物理性质不同分为水溶性和脂溶性两大类，其中脂溶性维生素A、D、E在人体的视觉能力、免疫功能、抗氧化抗衰老能力等诸方面都有着重要的生理功能。维生素不足会造成人体的亚健康，因此对于维生素的补充越来越受到人们的重视。婴幼儿及成人配方乳品是脂溶性维生素强化的重要形式之一。

配方奶粉基质复杂，我国和欧洲的关于食品中维生素 D 现行标准方法中，需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，分析效率很低。

赛默飞很早提出了二维液相的解决方案，采用一套液相两根色谱柱ZX切割的方法可以将维生素A、D、E异构体完全分离，方案被伊利、君乐宝等诸多乳品企业所采用。本文在前期研究的基础上，介绍更省时的超快速在线二维方案和既省时又省力的在线固相萃取-二维液相方案。

超快速在线二维方案

本方案仪器配置如下

仪器：

Thermo Fisher VanquishGX液相色谱仪

泵：

Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）

自动进样器：

Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）

柱温箱：

Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含两个Viper Only 2p-6p切换阀）

检测器：

Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纤池）

样品收集环体积：

500 μL

色谱软件：

变色龙Chromeleon 7.3

仪器连接图见图2。

图2  仪器连接图（超快速在线二维方案）

供试品溶液制备

参考GB 5009.82-2016的方法，精密称取固体奶粉试样约10 g（精确到0.01 g）于150 mL平底烧瓶中，用约30 mL 45 ℃～50 ℃温水使其溶解，混匀。于上述处理的试样溶液中加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀，加入30 mL无水乙醇，充分混匀后加入约20 mL 0.5 g/g的氢氧化钾水溶液混匀，在80 ℃恒温水浴振荡皂化约30 min后，取出立刻用冷水冷却到室温。

将上述皂化液转移入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙 醚混合液（1:1, V:V），振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另一个250 mL分液漏斗，加入50 mL石油醚-乙 醚混合液再次萃取，合并醚液，用约100 mL水洗涤醚液，重复3次，至醚液洗至中性。

醚液通过无水硫酸钠脱水过滤，滤液收入250 mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上在40 ℃水浴旋蒸至约2 mL，立即氮气吹干，用甲醇复溶转移至10 mL容量瓶后定容，上机分析。12min即可完成维生素A、D、E异构体7个化合物的分析，测定谱图见图3。

图3维生素A、D和E混合标准溶液分析谱图（a：维生素A；b：维生素D2和D3；c：维生素E）

在线固相萃取-二维液相方法

上面介绍的超GX液相平台方案给大家节省了分析时间，下面这个方案可在赛默飞常规液相上运行，结合在线固相萃取，可以实现皂化液直接上机分析，省时又省力。

样品皂化过程同上，皂化后，取出立刻用冷水冷却到室温，用50%乙醇水溶液转移并定容到100mL量瓶中。皂化液高速离心5～10min（>5000rpm）后用0.22μm尼龙材质针式过滤器过滤后上机分析。

该方案仪器配置上采用三泵两检测器双阀

实验所用仪器配置如下：

仪器：

Thermo Fisher VanquishGX液相色谱仪

泵：

Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）和Vanquish quatery Pump (VF-P20-A)

自动进样器：

Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）

柱温箱：

Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含两个Viper Only 2p-6p切换阀

检测器：

Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纤池），U3000 VWD3100 Detector（含11 μL流通池）

样品收集环体积：

500 μL

色谱软件：

变色龙Chromeleon 7.3

仪器连接图见图4，测定谱图见图5和图6。

图4  仪器连接图（在线固相萃取-二维方案）

图5. Vd测定谱图（a为对照品，b为样品）

图6. Va和Ve测定谱图（a为对照品，b为样品）

总结

赛默飞为大家提供了多种维生素A、D、E异构体的测定方案，方案涵盖常规液相和超GX液相、离线SPE和在线SPE，无论是对于现有仪器的升级改造还是全新平台的建立都可以找到对应的选择。现代化的仪器方法提高了奶粉样品中脂溶性维生素的分析效率，减少了每日多批次样品检测任务的繁重。

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