研究案例」基于QTRAP质谱，中药注射剂活性成分鉴定策略

注射用丹参多酚酸(SLI)是一种从丹参水提物中提取的冻干粉针剂，由丹参水溶性提取物制成。它具有活 血通络、抗 炎、抗氧化、神经营养和神经保护等功能。在临床上，它经常用于治 疗中风恢复期经络中的血瘀和侧支阻塞综合征（轻度至中度脑梗死）。由于SLI是一种成分复杂的中药注射剂，其临床应用的安全性一直是以往研究中不可避免的话题。迄今为止，如何全面表征 SLI 的活性成份，特别是具有潜在生物活性的微量成分，仍然具有很大的挑战。

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天津中医药大学的研究学者通过QTRAP® 系统独特的多种采集模式复合联用的方式，采用四种扫描模式（EMS-IDA-EPI，Pre-IDA-EPI，NL-IDA-EPI，pMRM-IDA-EPI）互为补充的新策略，并结合LightSight™软件自动预测相似结构未知物的功能，提出了一种新颖、灵敏且简单的策略，用于系统、高效、快速的分析鉴定SLI中的活性成分。

从 SLI 中鉴定出总共 171 种化合物。其中，27个痕量成分以前没有报道过。这种策略可以显著提高对于SLI中大量痕量活性成份的鉴定及异构体的区分，从而全面的鉴定到SLI中不同含量分布的活性成份。另外，对定性结果选出的13个代表性成份在15批次SLI中进行准确定量。其中，丹酚酸 A (Sal A)、Sal B、Sal D、紫精酸 (LA) 和迷迭香酸 (RA) 被证明是主要成分。

研究表明，这种新策略可以显著提高对于未发现的化学成分的鉴定，为鉴定其它中药的有效成分提供了很好的思路。

仪器设备

SCIEX超高效液相 ExionLC™ AD系统联用SCIEX Triple Quad™ 7500系统-QTRAP® Ready(四极杆-线性离子阱复合质谱系统)

图2. ExionLC™ AD系统和SCIEX Triple Quad™ 7500 系统

-QTRAP® Ready 

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样品信息：

样品：制备样品SLI时，用1 mL超纯水稀释。离心，过滤，上机分析。

标准品信息：

标准品：丹参素、咖啡酸、阿魏酸、异芥酸、丹酚酸C、原儿茶酸、紫草酸、香草醛酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸D、原儿茶酸醛、迷迭香酸。

通过将标准溶液与10%ACN的混合物连续稀释，制备了一系列工作标准溶液。

实验结果

1. 定性结果

1.2 SLI的四种扫描模式汇总结果

图3. 四种扫描方式的鉴定结果汇总的韦恩图

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如图3所示，将pMRM、EMS、Prec和NL四种采集方式进行了韦恩图汇总，表明四种采集方式均有各自的优势。在这四种扫描模式的帮助下，共鉴定到171种成分（详见原文），其中12种与标准品对照确认，保证鉴定准确度。由于pMRM 模式出色的灵敏度和选择性，可鉴定多达168 种化合物。EMS扫描模式排在第二位，检测到 76 种成分；Prec 和NL扫描模式大约有30个成份。这些成份主要分为以下类型：单体、二聚体、三聚体、四聚体酚酸及其异构体和衍生物（即糖基化、烷基化、水解、脱氧、脱羧、脱氢、氧化等）。此外，27种痕量成分以前从未报告过。

根据QTRAP质谱的复合式扫描方式，首先使用基于QTRAP质谱的EMS-IDA-EPI 扫描来获取非靶向化学信息，可以全面挖掘分析物的MS碎片信息。然后利用代表性组分的典型碎片离子进行半靶向的Prec和NL-IDA-EPI 扫描，可以选择性地检测与母核结构相似的化合物，从而得到更多结构相关且含量相对较高的化合物。随后，总结了碎片离子的特征和典型性，以及可能的衍生代谢途径，开发出灵敏度和选择性更高的pMRM-IDA-EPI 扫描方法，从而鉴定到不同浓度水平的活性成份，尤其是痕量化合物。因此，EMS、Prec和NL-IDA-EPI可以被视为pMRM-IDA-EPI 的有利补充策略，以获取更多对结构解析有用的片段信息。

如图4所示，化合物48和50（图4A和4B）通过EMS检测到，而47和38（图4C和4D）通过Prec（m/z109）和NL（198Da）分别检测到。

图4

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SLI中的酚酸具有结构相似但含量差异较大的特点。一些痕量成分，例如一系列酚酸衍生物，可能具有潜在的生物活性，但难以检测。pMRM扫描模式作为一种靶向策略，灵敏度高，干扰少，一次进样即可同时检测不同含量水平的组分。如图5所示，以图5 A的化合物75为例，它们仅通过pMRM 扫描模式可以检测到，并且根据碎片信息推测出甲酰化位点。该方法的高灵敏度还体现在异构体的鉴定上，以化合物79 为例，本研究共鉴定出6种异构体，pMRM均能检测到，而Prec和NL均未检测到。

图5

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2. 定量结果

2.1 13种标准品XIC提取离子流色谱图请见图6。

图6.13种活性成分标准品溶液的XIC提取离子流色谱图

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所有13种分析物均显示出良好的线性关系，线性相关系数r值大于0.997。通过向样品中添加低中高三个浓度的加标回收实验，从而考察本方法的回收率和精密度。对每种浓度水平进行一式三份分析，目标化合物的回收率在77.05%到99.30%之间，RSD值在0.45%到5.80%之间。

通过SLI的15批次样本进行定量分析，从图7可以看出，13种成分的含量差别很大。丹酚酸A（Sal A）、Sal B、Sal D、紫草次酸（LA）和迷迭香酸（RA）是主要成分。其中，Sal B的含量最 高（195.08-350.46μg/mg），然后是LA、Sal A和RA。但是，香草醛、阿魏酸、Sal C、原儿茶醛和原儿茶酸的含量较低，这些也是SLI的重要活性成分。

图7. 不同15 批次 SLI 中 13 种成分的含量分布

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参考文献：

Yaqing Guo, Rui Mao, Yuanyuan Zhang, Rongrong Li, Patrick Kwabena Oduro, Dandan Si, Lifeng Han, Yuhong Huang, Guixiang Pan. An integrated strategy for the systematic chemical characterization of Salvianolate lyophilized injection using four scan modes based on the ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 215 (2022) 114769 doi.org/10.1016/j.jpba.2022.114769;

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