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【打造梦想实验室】之抗体药物多维度表征和质控实验室

2022-08-31 10:27:19  来源:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司 浏览量:146次
【导读】分析超速离心技术也是进行蛋白异质性、聚集体及亲和力分析的精 准手段。

近两年,在抗体药领域迎来了一系列里程碑事件。2022年6月29日,康方生物PD-1/CTLA-4双抗卡度尼利单抗(AK104)获得NMPA批准上市,成为首 个获批上市的国产双抗,也是全 球首 款PD-1/CTLA-4双抗。2021年11月25日,NMPA通过优先审评审批程序批准了我国首 个国产PD-L1单抗上市,这也是全 球首 个皮下注射PD-(L)1单抗。同时,2021年有三款ADC药物分别被美国FDA和NMPA批准上市。


随着抗体药物多年的快速发展,在单抗药物趋于成熟的同时,抗体药物的形式也向多元化延伸,双抗、ADC、Fc融合蛋白、单抗偶联核酸药物等呈现百花齐放的状态。因此,对于抗体药物的表征也趋于复杂,需要多维度的正交分析手段,对各关键质量属性进行全面的分析表征。


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抗体药物发展趋势


目前已经有一些对于单抗药物表征的指导文件,如欧洲药品管理局(EMA)于2009年7月发布了有关单抗表征的监管文件。2015年3月,我国也发布了《生物类似药研发与评价技术指导原则(试行)》。另外,ICH Q6B为生物技术产品的表征提供了一套统一的国际公认原则,以支持单抗药物的市场应用。


对于抗体药物的表征和质控我们需要如何打造一个多维度又符合法规要求的实验室呢?


抗体药物理化分析

抗体药物表征和质控主要包括理化分析功能分析两大部分,理化分析又分为结构分析、糖基化修饰分析、异质性分析等,常用的方法如高分辨质谱、液相色谱、毛细管电泳等,如下图所示:


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结构表征和糖基化修饰分析

结构表征主要包括一级结构和二级结构,需要进行氨基酸的序列确认、N端和C端氨基酸序列变异性分析,游离巯基和二硫键等。抗体结构表征的目的,除了确认抗体药物的质量,另外一个核心目标是寻找可能影响抗体药物疗 效的关键氨基酸残基、翻译后修饰,进行相关工艺改造和确认,避免在工艺开发后期以及临床阶段产生不良影响。


对于抗体药物结构表征以及糖基化修饰的分析,质谱以及色谱柱是实验室必不可少的仪器工具丹纳赫生命科学旗下SCIEX的高分辨质谱Zeno TOFTM 7600系统,搭配艾杰尔-飞诺美的bioZen系列色谱柱可以高效完成抗体药物的一系列结构表征工作。bioZen系列色谱柱采用钛合金涂层柱管,可以减少蛋白残留,获得更高的稳定性和重复性。


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艾杰尔-飞诺美bioZen系列色谱柱


而Zeno TOFTM 7600系统拥有电子活化解离(EAD)碎片技术,可以获得新颖的结构信息,区分同分异构体,进行糖基,偶联精 准定位,可获得更高的氨基酸序列覆盖度。


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SCIEX 高分辨质谱Zeno TOFTM 7600系统


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Zeno TOFTM 7600系统对抗体药物的结构分析


另外SCIEX高分辨质谱可进行高分辨二级定量,对于ADC药物可进行偶联小分子毒素的定量分析,从而对游离payload进行监测。


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高分辨质谱的绝 对定量解决方案MRMHR


异质性分析

抗体药物的异质性主要指分子大小变异体及电荷变异体,这两种变异体在培养、纯化、制剂等阶段容易引入,是抗体鉴别和一致性评价的重要指标。抗体大小变异体检测常用方法包括分子量排阻色谱和CE-SDS,而电荷变异体常用的方法为离子交换色谱法和等电聚焦电泳法。因此,毛细管电泳仪是抗体药物表征和质控实验室需要配备的仪器


SCIEX的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统配备成熟的CE-SDS、cIEF和CZE试剂盒,可完成抗体药物的纯度、等电点以及电荷异构体的检测,并且其循环冷却控温技术,能够保证结果的稳定性和重复性。


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另外,分析超速离心技术也是进行蛋白异质性、聚集体及亲和力分析的精 准手段。由于将蛋白质放在相互作用而不是孤立的状态中进行研究,通过考察蛋白质的构象(折叠或伸展)、聚集的可逆性(相互作用系统)、化学计量学(解离状态)和异质性聚合状态,使用分析超速离心技术的测定更接近真实生理状态下的蛋白质。FDA也推荐采用分析超速离心技术对生物类似药的聚集体进行正交分析。因此,想要打造理想的抗体药物表征和质控实验室,贝克曼库尔特的分析型超速离心机Optima AUC则是十分推荐的配备仪器。


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抗体药物生物学功能分析

除了理化特性之外,生物学功能测定是对抗体药物有效成分的含量和药物效价的测定,是抗体药物质量评价体系中必不可少的部分,因而需要建立完整的体系进行表征。一般而言,功能测定包括生物鉴定结合活性测定生物鉴定是对抗体药物发生作用的机制的鉴定。比如CD20抗体(如利妥昔单抗)与表达细胞表面CD20结合,通过ADCC等效应,杀伤靶细胞。而PD-1单抗(如Keytruda)通过阻断PD-1和PD-L1的结合,恢复耗竭的T细胞的效应活性,杀伤肿瘤细胞。因为不同抗体药物发挥效应的机制不同,需要建立不同的鉴定方法,如 ADCC、CDC、抑 制细胞增殖、细胞毒性、细胞因子分泌能力、内化作用等。


抗体药物通过Fab段CDR区结合抗原,Fc段结合FcR, C1q, FcRn等,是抗体发挥其生物功能的基础,因而测定抗体的结合活性,可以部分反映抗体的功能。


以上两种检测项目, 常用的技术有ELISA、流式细胞术、表面等离子共振技术等,如下图所示:


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使用ELISA技术对抗体药物进行生物鉴定和结合活性的检测,酶标仪是不可或缺的工具丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器拥有不同类型的酶标仪,其中SpectraMax i3x多功能酶标仪具有光吸收、荧光、化学发光和FRET检测功能,兼容客户端模块化升级功能,可以根据需要任何时间随意升级至荧光偏振FP、HTRF、AlphaScreen、Western Blot、细胞成像和带有注射器模式下的快速动力学检测等,可进行基于ELISA的各类生物学功能检测及工艺相关杂质的检测。另外,配套的GxP软件,具有强大的函数和公式运算能力,内置超过21种曲线拟合方式,是进行生物活性评价的有力工具。


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美谷分子仪器的SpectraMax i3x

多功能酶标仪和GxP软件


另外,流式细胞术也是抗体药物的生物鉴定和结合活性检测的主流技术之一,因此流式细胞仪是实验室必备仪器贝克曼库尔特的CytoFLEX流式细胞仪在亲和力、抗体竞争、ADCC/CDC等效应功能分析、受体占有率等方面拥有成熟的检测方案,配套的DuraCLONE干粉试剂,可在常温下保存,避免由于运输与储存不当造成的试剂失效,预制好的干粉管还能减少不同试剂批次的差异,避免人工混合试剂时出错。


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贝克曼库尔特 CytoFLEX系列流式细胞仪

和DuraCLONE 干粉试剂


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流式细胞术进行抗体亲和力检测

及细胞增殖实验



工艺相关杂质及环境

工艺相关杂质,是指由生产工艺引入的杂质,包括微生物污染、热原、细胞成分、培养基中的成分等,这些杂质会影响最 终药品的安全性和有效性,在开发过程中对杂质的鉴别、定量、定性和控制也是非常重要的。


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其中,对于宿主蛋白残留,一般推荐使用ELISA方法,但有时ELISA法的蛋白质覆盖度有限,通常会结合使用质谱法以达到完整的覆盖。因此,实验室同时配备酶标仪和质谱能够获得宿主残留蛋白比较全面的信息,美谷分子仪器的酶标仪和SCIEX的X500B或 Zeno TOFTM 7600高分辨质谱系统则是推荐的选择。


不溶性微粒检测,药典建议采用光阻法及显微计数法进行检测,因此实验室也需要配备相关设备。丹纳赫生命科学可提供这两种药典推荐的不溶性微粒检测方法的解决方案和相关检测仪器。


贝克曼库尔特的 HIAC 9703+不溶性微粒检测仪,采用光阻法原理,满足多国药典对各类注射剂药物的测试要求,同时根据USP787和CP0903小体积测试规定,对于珍贵样品单次检测体积只需200μL,即单个样品体积不到1.5mL即可完成不溶性微粒的检测,在大大节省测试样本的同时保证制剂的高质量品质。


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贝克曼库尔特的HIAC 9703+ 不溶性微粒检测仪


徕卡显微系统的DM4P 偏光显微镜使用透射正交偏光进行不溶性颗粒观察,观察时,药物颗粒呈亮白色,载玻片呈黑色,色差明显,可以消除分析过程中载玻片颜色对微粒识别的干扰。配合专业的清洁度检测的解决方案:scanning stage + LAS X navigator, 可以快速自动检测出一定尺寸范围内的颗粒数量。


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徕卡DM4P 偏光显微镜


此外,在进行GMP生产时,需要对生产车间和实验室的空气颗粒进行检测,以确保实验室环境的洁净程度,因此空气颗粒检测仪也是实验室标配设备。贝克曼库尔特的MET ONE 3400+便携式空气颗粒计数器可进行图层点位,实景展示;即插即用,网络互联;并且软件合规,操作简单轻便,还易清洁;是进行空气颗粒检测的有力工具。


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贝克曼库尔特的MET ONE 3400+

便携式空气颗粒计数器



标签:抗体药物理化分析 , 艾杰尔-飞诺美bioZen系列色谱柱 , SCIEX 高分辨质谱Zeno TOFTM 7600系统
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