高内涵应用案例之 3D 免疫细胞迁移研究

案例特点：

• 创建易于规模化的与高内涵兼容的复杂的细胞迁移分析

• 对免疫细胞动力学进行定量评估，生成高通量数据，例如细胞数量和细胞迁移距离

简介

在炎症过程中，通过血管系统向炎症部位募集 T 细胞是一个关键因素。这些 T 细胞被不同的因素招募，例如促炎细胞因子（TNFα、IFN-γ）和趋化因子梯度。在募集并粘附到内皮后，T 细胞需要通过称为跨内皮迁移（TEM）的过程穿过血管壁迁移到发炎的组织。这需要通过活体组织的复杂 3D 环境成功导航，并通过重塑细胞外基质（ECM）和/或通过进行特定的细胞适应来挤压致密结构。

在本研究中，我们利用 MIMETAS 公司的 OrganoPlate 3-Lane 40 板材，设计了一种体外实验。在灌注条件下结合血管结构研究 T 细胞动力学，用高内涵进行成像分析来检测细胞在不同时间点的迁移情况。

实验材料

实验方法

模型

图注：在 OrganoPlate 中建立 T 细胞灌注内皮芯片模型。

A )示意图显示了 OrganoPlate 3-Lane 40 的 40 个微流控芯片之一，包括三个通道：两个培养基灌注通道和中间的凝胶通道，每个通道由 Phaseguides 分隔。这些通道连接在芯片的中心，在观察窗口（OW）中。

B )建立免疫细胞灌注内皮芯片模型的细胞种植方案示意图。

为了评估灌注条件下与血管结构相结合的 T 细胞动力学，我们在 OrganoPlate 3 通道中培养了内皮血管。在顶部灌注通道中，内皮细胞以 10,000 个细胞/芯片的密度接种在 I 型胶原细胞外基质（ECM）上。附着后在灌注条件下保持培养，在灌注通道内生成 3D 微血管。通过以剂量依赖性方式添加促炎细胞因子 TNFα 来模拟微血管的炎症状态，诱导参与跨内皮迁移的内皮的粘附特性。在这个模型中，通过在 3 通道板材的底部通道中加入趋化因子，得到一个趋化因子梯度 。CD3+ T 细胞使用 CD3 / CD28 人 T 细胞激活剂 Dynabeads 刺激或未刺激 48 小时后标记细胞，可以实时跟踪 T 细胞从内皮血管外渗到邻近的细胞外基质过程。

实验准备

培养 CD3+ T 细胞，部分组使用人 T 细胞激活剂 Dynabeads 刺激 48 小时。

成像和分析

使用 ImageXpress Micro Confocal 系统（Molecular Devices）定期捕获 T 细胞外渗和组织的图像。采用 10 倍空气物镜（0.45NA）和 60μm 共聚焦转盘以 0.69x0.69x3µm/pixel （XYZ）的分辨率获取 Z 轴的荧光图像。然后图像沿 z 轴做了投影，创建了图片的最 大荧光强度投影（MIPs）。

然后对所有图像使用 MetaXpress 软件（Version 6.6，Molecular Devices）自定义模块编辑器（CME）进行分析。简单地说，CME 包含细胞核计数应用模块，在该模块中，T 细胞根据大小和与背景的荧光差值被识别。设置一系列分析滤镜等步骤来识别迁移至 ECM 通道的细胞群。每个实验都对 ECM 通道的位置进行精 准识别，以校正不同板之间和板加载时的位移变化。

图注：MetaXpress 自定义模块编辑器（CME）用户界面。图像处理步骤显示在页面左边，当前步骤的图像和结果的预览显示在右边，完整的工作流显示在底部的缩略图中。

图注：自定义模块编辑器（CME）设置。

A )展示了用于识别 T 细胞类群的主要步骤。利用细胞核计数应用模块检测图像中的所有细胞。识别结果通过位置（Centroid Y）和区域进行过滤，以更准确地识别 ECM 通道内的细胞。如果需要，可以再加入位置的附加过滤，根据细胞向底部通道的迁移程度进行分类。具体的测量参数，包括细胞数，面积，强度，圆度，也可以通过测量参数选项卡选择。

B )内皮血管与 CD3+ T 细胞的明场相差图像。

C )当前样品的 Cy5 荧光信号。

D ) CME 分析结果显示位于 ECM 通道中 CD+ T 细胞的分割图层。蓝色标记的细胞位于 ECM 通道的上半部分，黄色标记的细胞位于 ECM 通道的下半部分。

实验结果

无论 CD3+ T 细胞受刺激与否，均能观察到细胞的跨内皮迁移（TEM）。两类细胞均能观察到时间依赖性效应，尽管在未受刺激的条件下有更明显的趋势。在受刺激的条件下，在 24 小时的时间点几乎没有观察到 TEM 的增加；而在未受刺激的条件下，在 24 小时和 48 小时的时间点观察到受 TNFα 剂量依赖性的细胞迁移。在 48h 时间点，受刺激的T细胞发生跨内皮迁移的总数量明显大于未受刺激的组。TEM 似乎是由非刺激条件下 TNFα 介导的效应和刺激条件下的刺激过程驱动的。

图示：有/无预激的 T 细胞在 TNFα 作用后的迁移响应。

A )未受刺激的T细胞在 TNFα 作用 0 小时、4 小时、24 小时、48 小时的图像。观察到内皮细胞屏障对面的细胞数量随着时间的推移在增加。

B ) TNFα 作用下，受刺激 T 细胞的迁移数量。

C ) TNFα 作用下，未受刺激 T 细胞的迁移数量。x 轴显示 TNFα 的作用浓度，以 pg/ml 为单位。

总结

我们利用高通量微流控平台开发了一种新颖的 3D T 细胞外渗和迁移测定法。使用高内涵成像分析系统，可以精确提取和评估不同条件下单个 T 细胞的迁移行为。此迁移实验捕捉了在灌流下 T 细胞对血管内皮的附着，并由血管壁外渗到下面的组织中。该实验不受人工膜的影响，并允许存在 3D ECM 样支架和多细胞的共培养，这是模拟体内环境的关键要求。我们希望，该实验可以提高目前对 T 细胞迁移行为的认识，并带动免疫肿瘤学和自身免疫领域新疗法的发展。