环状与线状RNA，孰优孰劣

背景

近年来，人们对环状RNA（circRNA）的兴趣日益浓厚，因为它们除了具有生物标志物潜力外，还涉及许多生物过程和疾病。

然而，一开始circRNA并没有得到科研人员的重视，这是为什么呢？

1971年，科研人员在研究马铃薯纺锤块茎病时，发现了类病毒。区别于病毒，类病毒没有蛋白质外壳包被，而且它的基因组是单链闭合的RNA分子。

1979年，通过电子显微镜，研究人员观察到真核细胞的细胞质中存在圆环形RNA。

（图片来源：Hsu and Coca-Prados, 1979）

但是，由于早期的RNA文库制备常使用poly A富集的方式，而circRNA没有游离的5’和3’末端，导致大量circRNA的信息被遗漏。所以，在随后的几十年里，circRNA并没有引起研究人员的太大关注，一直被认为是错误剪接的结果。

随着21世纪RNA-seq技术和生物信息学的发展，大量circRNA相继得到鉴定，同时还发现了circRNA的更多功能。

（图片来源：可画）

环状RNA与线状RNA从本质上有什么不同？为什么说环状RNA更具研究价值呢？

与线状RNA的区别

1

剪接方式

经典线状RNA的剪接方式：从最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来，形成一个连续的RNA分子。成熟的线状RNA具有5’端帽子结构和3’端poly A尾巴。

环状RNA的剪接方式：通过RNA特异性反向剪接，后面外显子的尾端与前面外显子的前端相连，形成不具有5’端帽子和3’端poly A尾巴的共价闭合环状结构，通常由一个以上外显子构成，部分包含内含子。

2

稳定性

核酸酶一般通过识别线状RNA分子的末端发挥作用，而circRNA没有5’和3’末端结构，因此circRNA不会被RNA酶和核酸外切酶降解，使得circRNA比线状RNA具有更长的半衰期和更高的稳定性。

由于circRNA更稳定，大部分circRNA在胞浆中富集，其丰度甚至可以达到相应线状RNA的十余倍。并且大多数外显子circRNA的半衰期超过48h，而mRNA的平均半衰期为10h。

所以，circRNA比线状RNA在细胞中的表达量更高，表达时间更长。除了可以在体内长效稳定表达外，circRNA药物还能重复给药，且能够通过多种给药途径用药。

（图片来源：可画）

3

 翻译蛋白质

尽管大部分circRNA为非编码RNA，仍有少数circRNA被证实具有编码蛋白质的功能。

早期研究表明circRNA存在内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）顺势调控元件，这个元件能够被核糖体识别，使得circRNA具有翻译蛋白的功能。

近年有研究发现，在没有任何特定的IRES元件的情况下，含有无限开放阅读框的合成circRNA可以在活的HeLa细胞中通过滚环扩增（RCA）机制，有效翻译出不同大小的蛋白质产物。甚至还可以利用有限的核苷酸序列翻译出更大分子量的蛋白质，这些是线状mRNA无法实现的。

以上这些发现为未来circRNA的研究提供了新的方向，可以为疾病诊断和预后提供新的潜在生物标志物。由于circRNA高度稳定、编码抗原表达量高、适应性广等优点，已有国内研究团队针对新冠病毒及其突变株开发出了环状RNA疫苗。

另一方面，有学者提出并论证了：绝大多数（>97%）circRNA来自于错误剪接的无功能或有害产物，这一“分子错误”假说。但这一论断并不直接否定对于circRNA的生物学功能，而是从系统层面理清了circRNA的生物学地位。

功能性研究解决方案

目前，circRNA的发生和作用机制尚未完全明确，其在生命活动中发挥的作用以及分子机制还需要进一步的深入研究。丹纳赫生命科学关注circRNA研究的需求，提供circRNA功能性研究解决方案。

NGS建库

想要研究circRNA首先要筛选出目标circRNA，可通过简单的RNase R预处理，将线性RNA消化，然后进行RNA建库。丹纳赫生命科学旗下IDT两款RNA建库试剂盒——xGen RNA 文库制备试剂盒与xGen Broad-Range RNA文库制备试剂盒助力转录组表达谱分析，具有以下优点：

• 100pg-100ng 起始RNA建库，满足不同样本起始水平

• 单链接头连接，无二聚体产生风险

• 无需优化接头的稀释浓度

CRISPR/Cas9基因编辑系统

为了明确circRNA在通路中的作用，常用CRISPR-Cas基因组编辑系统来进行敲除/敲入基因序列的研究，IDT Alt-R CRISPR基因编辑系列产品提供以下服务：

• 提供CRISPR-Cas9与CRISPR-Cas12a等多种基因组编辑解决方案，适配更广泛的实验需求

• Cas9 crRNA与tracrRNA、Cas12a crRNA合成服务，可简易在线定制

• 搭配Alt-R CRISPR蛋白，有效提高靶向率，相比质粒诱导方法更准确

• 更小的细胞毒性，引发的先天性免疫应答更低，安全性更高

蛋白质水平分析

circRNA翻译成蛋白质后，需要对蛋白质进行定性和定量分析。

• 丹纳赫生命科学旗下SCIEX的高分辨质谱ZenoTOF™ 7600 系统：创新多重碎裂技术及更高灵敏度，融合定性的灵活性与定量功能，助力circRNA编码蛋白质的定性分析。

• SCIEX 7500 系统：可使样本的定量灵敏度达到新高度，精 准定量目标circRNA编码蛋白质。

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