顶刊药筛的选择？发Cell和新冠药筛都需要用到它

药物筛选无论在医学研究领域或是药物开发领域都是十分重要的环节，在这个过程中筛选得到靶向特定靶点的高生理活性的化合物无疑是至关重要的。

现如今繁多的化合物种类和日渐增加的新靶点，都指向了高通量药物筛选的必要性，而无论是使用较为传统的ELISA，还是通过FRET、HTRF等方法，都可以通过高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm进行检测，一次性完成6、24、96、384乃至1536/3456孔板的检测，极大地提高了实验效率和准确性，能够更好地满足实际实验中药物筛选需要。无论是发表在Cell上，筛选靶向TLS抗肿瘤药物的研究，还是在新冠大流行背景下，对靶向新型冠状病毒主蛋白酶的抗病毒 药物的筛选，或者是在常规实验中检测细胞内H2O2水平的需求，都可以通过SpectraMax Paradigm这一台仪器完成，下文将具体就相关实验的设计、结果与具体实验流程展开介绍。

1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy Cell 66.850
在肿瘤治 疗领域当中，传统的通过损伤DNA的方式杀伤肿瘤细胞的化学疗法一直具有无法取代的地位。而在这种治 疗之下，细胞可以通过跨损伤合成（TLS）这个过程利用专门化的DNA聚合酶从而绕开DNA损伤的区域，以牺牲DNA保真度为代价促进细胞存活。而此篇文章的重大意义在于通过筛选找到了这样一种可以靶向TLS过程的小分子抑 制剂JH-RE-06，可以阻止诱变POLζ的募集来破坏诱变TLS，并且通过后续实验验证得到顺铂、JH-RE-06可双药联合相较于顺铂的单药化疗来说对小鼠的耐药肿瘤模型上显示出更显著的肿瘤抑 制作用，并且可以降低由于化疗所引起的继发性肿瘤的可能性，从而降低传统化学治 疗的副作用。

Figure 1 阻断 REV1 CTD-REV7相互作用的小分子抑 制剂JH-RE-06的发现与其特征

       在化合物的筛选步骤中应用到了ELISA实验。在 ELISA 实验(Figure 1A)中，将纯化后共表达REV3肽链的 His8-REV7固定在 Ni2+-NTA 包被的孔中，并通过辣根过氧化物酶(HRP)耦联的抗FLAG抗体检测其在小分子抑 制剂存在情况下结合FLAG标记的cREV1 CTD的能力。作者选择TMB作为底物，反应结束后通过使用高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm检测450nm处的吸光度来寻找可以和REV1 CTD-REV7相互作用的小分子。

在这个过程中，作者从LOPAC 文库和PRESTWICK 文库中筛选了1万个结构不同的化合物，也在KCB（Korea Chemical Bank）化合物库中筛选了具有代表性的化合物。最 终鉴定得到JH-RE-06，可以10mM浓度下有效地抑 制REV1-REV7相互作用，作为后续的研究对象[1]。

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移） 基于非辐射的能量跃迁。将一个蛋白上耦联供体（donor），另一个蛋白上耦联受体（acceptor），以下图为例即供体为CFP，受体为YFP。当两个蛋白间距离较远时，CFP可以在433nm波长的荧光激发下发射475nm波长的荧光，而YFP不被激发；只有当供体和受体靠近时，即两个蛋白之间存在相互作用时，可以发生FRET，使得YFP被激发，产生波长为530nm的荧光。可以应用于细胞内分子间相互作用、细胞膜受体蛋白之间相互作用等研究。而使用高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm的FI卡盒（Fluorescence Intensity）可以同时完成对双荧光信号的检测，检测速度更快且结果更准确，不受光源强度、电压等变化的影响。

2. Both Boceprevir and GC376 efficaciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease Nature communications 17.694

中国科学院微生物研究所齐建勋课题组在Nature Communications上发表的研究证实丙肝药物博赛泼维（Boceprevir）和GC376（临床前期药物，针对猫传染性腹膜炎病毒的抑 制剂）可以通过靶向新型冠状病毒的主蛋白酶（main protease，Mpro）起到病毒抑 制作用。

Table 1. 18种待筛抗蛋白酶化合物

新冠病毒的主蛋白酶在病毒多聚蛋白的加工和成熟过程中起到重要作用，也因此是研发治 疗新冠病毒 药物的重要靶点。首先，作者发现了新冠病毒Mpro与其他冠状病毒Mpro之间的同源性，因此选择了靶向不同病毒蛋白酶和蛋白酶体的18种化合物进行进一步筛选（Table 1）。

进一步作者通过在单一浓度下，在体外进行FRET实验对这些化合物进行筛选（Figure 1 a, b）。最 终发现有两种抑 制剂，即Boceprevir 和GC376，可以很好地抑 制酶活性。RFU值（relative fluorescence units）是在37度的条件下，激发波长为360nm，发射波长为490nm，使用高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm检测1小时得到[2]。

3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes Biochem Biophys Rep. 3.322

       Glady, Azela等人在这篇文章中试图探究UVB-诱导的活性氧的来源和作用，最 终得出结论：Nox-1介导的ROS的产生，是UBV通过p38激活和炎性细胞因子生成所导致的细胞毒性和炎症所必须的，所以，作者认为Nox-1可以作为UVB接触后所产生的细胞毒性和炎症的一个可能的治 疗靶点。

       在实验的过程中作者需要对细胞内的H2O2水平进行检测，主要通过向细胞内转染H2O2敏感性探针pHyPer cDNA质粒，在完成稳转株的构建后通过使用高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm对细胞荧光进行检测，YFP与CFP激发波长的比值用来衡量细胞内H2O2的水平[3]。

作者通过对Nox1的敲除发现可以抑 制UVB诱导的即时或迟发的细胞内H2O2水平的升高，可以看出Nox1-siRNA组在UVB处理0.5h、3h和10h时，YFPex/CFPex的比值显著低于对照组（Figure 1G）。

高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm

高通量药物筛选平台SpectraMax Paradigm可以进行光吸收、荧光、时间分辨荧光（包括 HTRF）、荧光偏振、AlphaScreen、AlphaLISA 以及化学发光的检测。检测卡盒式的模块化设计，不仅可以满足目前检测的需求，还可以根据未来应用需求灵活的进行升级，通过插入新功能检测卡盒，仅需要短短几分钟完成对读板机的升级，是您药物筛选的得力助手。