美国宾夕法尼亚大学的Paul A. Janmey团队《Biomaterials》：调整灰白质比即可轻松模仿脊髓机械异质性

生物工程支架具有模拟组织机械性能的特质，但天然组织的机械性能通常是不均匀的且难以表征，特别是脊髓的神经特性。递送到受伤脊髓以刺激轴突连接的支架通常使用沿着头-尾轴的引导线索匹配天然组织的各向异性，但是当前的方法没有模拟宿主组织力学的异质性。基于此，来自美国宾夕法尼亚大学的Paul A. Janmey团队描述了一种修改DLP打印支架的方法，该支架模拟由白质和灰质比例变化引起的脊髓机械异质性，与表现出均匀机械特性的对照组相比，这种方法能够有效改善轴突浸润。

相关研究成果以“Matching mechanical heterogeneity of the native spinal cord augments axon infiltration in 3D-printed scaffolds”为题于2023年2月16日发表在《Biomaterials》上。

1. 脊髓力学性能的微结构表征

为了检查脊髓组织的异质性，作者首先进行了使用AFM和张力计的初步实验，以询问沿着横向解剖平面的灰质和白质的差异。为了澄清这些研究之间的差异，对脊髓进行了AFM和张力测量实验(图1A-B)。将组织分为三个区域：骶骨、胸/腰椎和颈椎，以评估解剖水平是否影响脊髓的机械性能。AFM以前已经被用来表征脊髓力学，显示灰质比白质表现出显著更高的弹性模数，尽管在三个水平之间没有统计学差异(图1C)。图1D显示了所有三个区域的灰质和白质的松弛因子，双因素方差分析显示灰质和白质之间存在统计学差异，尽管水平之间没有差异。这些结果表明，与白质相比，灰质表现出更坚硬和更多的粘弹性力学，并且灰质和白质沿脊髓长度的微观结构力学性质没有差异。为了验证这种力学异质性也存在于大鼠脊髓内，对大鼠脊髓颈部水平的切片进行了原子力显微镜检查，发现灰质区域的弹性模数明显高于周围白质区域。

图1 牛脊髓组织的微结构力学特性

之后流变学被用来描述颈椎、腰椎和骶骨水平的脊髓的体积力学特征。对来自三个独立牛脊髓的每个水平(颈椎、腰椎和骶椎)的三个不同切片进行了流变学检测。给定AFM测试的结果，这些实验测试了这样的假设，即解剖层面的整体力学性质的差异是由于灰质与白质的比例不同。因此，在取自不同水平的5-6 mm厚的脊髓横切面上测量了剪切储能和损耗模量以及灰质和白质的横截面积。图2A-C显示了在三种不同的牛脊髓上进行的流变学实验。其中两只动物的颈部和第三只动物的骶部测得了最 高的存储和损失模数。为了使整体测试与AFM测量结果一致，即在脊髓的灰质或白质中没有发现差异，脊髓横切面(图2D-F)，横切面中灰质的百分比表示为总面积的百分比(图2G-I)。这些结果表明，沿脐带的整体流变特性是由脐带横截面中灰质与白质的比率的差异决定的。

 图2 脊髓组织宏观结构力学特性的表征

2. 灰质和白质的显微结构分析为了深入了解导致机械异质性的灰质和白质之间的结构差异，采用免疫组织化学方法检测了沿脊髓不同水平的两个区域的细胞核、髓鞘和层粘连蛋白表达的差异。图3显示了颈椎、腰椎和腰椎在开始处固定的切片(图3A、C、E)，并在6小时后结束(图3B、D、F)的力学表征实验。DAPI、髓磷脂和层粘连蛋白的定量分析表明在所有水平的白质和灰质区域之间存在显著差异。

图3 灰质和白质的免疫组织化学分析

3. 具有不同机械性能的3D打印支架基于以上结果，作者开发了一种新的DLP方法来制造支架，该支架模拟了通过牛脊髓微结构力学测试观察到的灰色和白色区域之间的硬度差异（图4A）。作者创建了灰度图案以在0-100%之间改变光强值，代表黑色到白色，以调节GelMA水凝胶的聚合程度。为了验证这种方法，交替强度的测试图案被打印在正方形块中。图4B显示了用于这些初步打印的灰度掩模，在10x10x3 mm的块中具有1 mm厚的条纹，用张力计量法验证力学性能的差异。对这些数据的量化和随后的统计分析表明，每条条纹之间存在显著差异，表明暴露在高光强下的区域表现出比低光强区域更坚硬的力学性能(图4C)。这些结果验证了3D打印支架可以实现异质性，以模拟灰质和白质区域之间的硬度差异。

 图4 3D打印支架的特点

4. 脊髓损伤三维打印支架的力学特性研究在验证了具有异质机械性能的3D打印支架的方法后，水凝胶被打印出来以模仿大鼠T10几何形状。图5 A显示了同质支架（以用于异质支架白质的相同光强度打印）和一个异质支架中灰质和白质区域内支架的SEM图像。量化表明，在异质支架的模拟灰质中孔径减小（图5B），为了进一步验证模拟的白质和灰质之间的差异，对暴露于不同光强度的散装水凝胶进行了压缩测试。压缩测试表明，与代表白质的水凝胶相比，暴露于用于创建灰质区域的光强度的水凝胶表现出明显更高的弹性模量（图5C）。在验证了暴露于不同像素强度的支架的机械性能之间存在差异后，获得了同质和异质支架的图像，以证明不同的刚度不会影响支架的几何形状（图5E）。图 5F-H 显示了均质和异质支架中弹性模量的热图，异质支架内的灰质表现出明显高于周围白质和以75%强度打印的均质水凝胶的弹性模量。此外，异质支架中的灰质硬度与以100%强度打印的同质支架之间没有显着差异（图5I）。总之，上述结果表明机械异质性可以在脊髓支架中实现。

图5 3D打印异质支架的特点

5. 评估轴突渗透到具有异质机械性能的支架中最 后，作者进行移植研究以确定异质支架与同质对照相比是否会引起增加的轴突浸润。异质支架和刚度与异质支架匹配的同质支架都被移植到急性脊髓损伤模型中。图6A显示了T10支架的水凝胶制造、损伤模型和移植示意图。异质支架显着增强了感觉轴突的浸润（图6C）。为了进一步评估轴突浸润到支架中，检查了移植支架的延髓和尾部区域是否存在Tuj纤维。图6D显示Tuj+轴突的存在仅位于支架的延髓区域，具有与异质支架的“白质”相匹配的均质力学。图6E表明与灰质匹配的均质支架中的类似响应。然而，在异质支架的头侧和尾侧部分均观察到Tuj+纤维的浸润和生长（图6F），表明机械异质性刺激了神经元再生。

为了确定异质支架是否刺激轴突生长增加，在两种支架类型的白质区域评估了Tuj纤维的量化，表明异质支架显着促进了Tuj+纤维的生长（图6G）并刺激了浸润与均质水凝胶相比的距离（图6H）。总体而言，这些结果表明，具有与宿主组织各向异性相匹配的异质机械性能的 3D 打印支架对轴突的浸润和再生具有有益影响。

 图6 移植后轴突浸润的检查

综上，横向脊髓部分的大量流变学测试表明，脊髓的粘弹性特性沿其长度发生变化。但不是由于微观结构特性的差异，AFM和张力测量表明灰质和白质的刚度不会根据水平而变化。因此，沿线的整体机械性能差异是由灰质和白质相对量的差异引起的。对现有数字光处理技术的修改有助于打印具有异质机械性能的支架，提供了一种模拟灰质和白质之间刚度差异的方法。急性横断大鼠模型的移植实验表明，与均质机械特性相比，具有这种异质机械特性的支架会导致更大的轴突浸润。尽管这种差异背后的机制尚不清楚，但这些结果强调了开发模拟脊髓组织空间异质性的生物材料的重要性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122061

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