更温和？更简单？更可靠？一种抗原特异性 T 细胞克隆的新方法

2023-08-18 11:22:28 271阅读次数

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前言：

抗原特异性 T 细胞克隆技术常应用在开发治疗性疫苗和转基因 TCR 细胞过继转移（ACT）等多种癌症免疫疗法策略中，目前存在的主要挑战是识别免疫原性肿瘤特异性抗原源性肽。通过反向免疫可以预测和识别源自靶抗原基因序列的免疫原性肽^[1-3]，流程可分为识别肿瘤特异性转录本，预测和确定蛋白酶体切割位点，预测 HLA 分子与多肽结合和实验验证，评估所选抗原肽的体外和体内免疫原性潜力以及分离特异性细胞溶解性 T 细胞克隆和验证其肿瘤细胞识别能力。因此，开发癌症免疫疗法策略需要分离对免疫原性肽具有特异性的 T 细胞克隆。

目前，有限稀释是最常见的 T 细胞克隆方法，依赖于统计概率来分离 T 细胞的单克隆，这种方法分离效率低，并且分离单克隆过程往往需要二次克隆，使基于有限稀释的单克隆分离成为一种费力、低效、昂贵且耗时的方法。近日，法国勃艮第-弗朗什孔泰大学 Romain Loyon 团队在 SLAS 技术发表文章中介绍了一种将磁性细胞分离和基于阻抗的单细胞分离技术相结合的新流程，该流程可温和、简单和可靠地分离特定 CD8+ T 单克隆细胞（Fig.1）^[4]。DispenCell 依赖于基于阻抗的移液技术，可在细胞分配期间检测和记录单细胞阻抗信号。用 DispenCell 将细胞悬液装载到感应枪头中，根据指令将单个细胞单独分配到不同规格孔板的一个或多个孔中，然后使用 DispenSoft 进行单细胞质量控制^{[5, 6]}。

Fig.1 使用 DispenCell 分离抗原特异性 T 细胞概述

实验过程：

首先采集健康供体的血液细胞，用密度梯度离心法分离健康人血中的外周血单核细胞 PBMC 细胞。

在体外，作者利用 1μg/mL CEF 肽库（CTL Eu-rope GmbH）处理来自健康供体样品的总 PBMC，结合 MHC-I 分子，活化特异性 CD8+ T 细胞，并用 IL7（5ng/mL）和 IL2（20UI/mL）细胞因子培养细胞 14 天。

用 live/dead 染料标记死活，anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8 对细胞膜蛋白进行染色后，Cytofix/CytopermTM 对细胞进行固定和破膜，用 anti-IFNγ 和 anti-TNFα 染色，通过流式细胞术分析评估 T 细胞对 CEF 肽库的特异性，测定约 25% 的 CD8+ T 细胞在 CEF 刺激下产生了 IFNγ。

对分泌 IFNγ 的 CEF 特异性 CD8+ T 细胞通过 IFNγ 磁性介导的 T 细胞分选进行富集，并在含有辐照饲养层细胞、150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的条件下培养 14 天。细胞内 IFNγ 染色后，通过流式细胞术分析 CD8+ T 细胞特征进一步增强了（ Fig. 2）。

Fig.2 流式分析工作流程中 CD8+ T 细胞的特征

使用 DispenCell 对富集的 CEF 特异性 CD8+ T 细胞进行单细胞克隆。研究人员共分离了三块 96 孔板用于测试 DispenCell 分配细胞克隆效率和可重复性，并使用 DispenSoft 对单细胞分离进行基于阻抗的质量控制。同时采用有限稀释方法作为对照，分离后在含有辐照饲养层细胞，150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的条件下 T 细胞培养扩增 14 天。

根据基于颗粒大小的直方图（Fig.3A），将筛选阈值设置为 100 欧姆，以区分单个 T 细胞与碎片。软件将含有不同数目颗粒的孔用颜色加以区分以便质量控制（Fig.3B）。在该图中，只有包含单个细胞的孔以绿色标记，而其他孔则以红色标记，阻抗显示单细胞（Fig.3C）和双细胞（Fig.3D）的峰值特征。使用相同的软件，我们可以访问每个孔的阻抗曲线，以进行额外的质量控制。

Fig.3 DispenCell 分离单细胞的质量控制

单细胞分离平均效率（绿色孔的百分比）为 83%，每块板的平均分配时间为 8 分钟。结果证明了 DispenCell 基于阻抗的单细胞分配技术的高效性和实用性，另外根据阻抗分布，软件可提供即时的单克隆性理论证明。

作者为了进一步证明 DispenCell 分离后细胞的单克隆性，对 DispenCell 或有限稀释克隆方法分离的 CD8+ T 细胞克隆进行了 TCRβ 链测序。通过检测同一样品中 TCRβ 位点的单克隆重排来证明样品的单克隆性。测序分析表明，两种克隆方法的样品中 TCRβ 链主要为单克隆重排（Fig.4A），在使用 DispenCell 生成的 27 个生长克隆中，其中 25 个呈现对应于 T 细胞单克隆的单一优势 TCR β 链序列（Fig.4B）。而通过有限稀释，仅 18 个 T 细胞克隆表现单一优势 TCRβ 链序列。DispenCell 提供了比有限稀释更高的单克隆效率和可靠性。

作者研究了 DispenCell 克隆方法对 CD8+ T 细胞功能的影响。使用 CEF 肽库进行体外刺激后，细胞内流式细胞术分析表明，通过 DispenCell 分离并扩增的 CD8+ T 克隆能够产生大量的 IFNγ 和 TNFα（Fig.4C）。这些结果表明，DispenCell 克隆方法不会改变特定 CD8+ T 细胞克隆的功能。

Fig.4 CD8+ T 细胞单克隆性和功能特征的验证

综上，将磁性细胞分选与 DispenCell 单细胞克隆技术相结合，可温和有效地分离活的单 CD8+ T 克隆。对比有限稀释，使用 DispenCell 技术可以使 T 细胞克隆生成更容易，从而优化反向免疫学策略以推进癌症免疫疗法的发展。

讨论

这一新工作流程为免疫学及其他领域蓬勃发展的常规克隆实验提供了一种非常简单且经济实惠的方法。本研究中使用的感应探针是为 CHO 细胞系开发而开发的，其直径比 T 细胞大两到三倍。目前有研究希望改善机器信噪比以进一步提高 DispenCell 的速度和可靠性^[5]，其中一种简单方法是根据细胞大小调整枪头孔径的大小。我们预计，孔径减小（约 20 μm）的新检测吸头在用于 T 细胞时应具有更高的分配可靠性。

参考文献

1. Celis, E., et al., Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(6): p. 2105-9.

2. Boon, T. and P. van der Bruggen, Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J Exp Med, 1996. 183(3): p. 725-9.

3. Maecker, B., et al., Linking genomics to immunotherapy by reverse immunology--'immunomics' in the new millennium. Curr Mol Med, 2001. 1(5): p. 609-19.

4. Ben Khelil, M., et al., A new workflow combining magnetic cell separation and impedance-based cell dispensing for gentle, simple and reliable cloning of specific CD8+ T cells. SLAS Technol, 2022. 27(2): p. 130-134.

5. Bonzon, D., et al., Impedance-Based Single-Cell Pipetting. SLAS Technol, 2020. 25(3): p. 222-233.

6. Muller, G., et al., Traceable Impedance-Based Dispensing and Cloning of Living Single Cells. SLAS Technol, 2020. 25(3): p. 215-221.

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