Nature Catalysis 南京大学黄小强等人在可见光直接激发驱动的新光酶催化方面取得重要进展

融合化学创新的生物制造，是可持续生物经济发展的原动力，也是当前中美科技博弈的焦点之一。生物制造的关键“芯片”是酶，然而现有酶的催化功能有限等问题极大地限制了生物制造的范畴。南京大学黄小强课题组，自2021年建组以来，致力于将化学与生物学相融合，以实现新酶元件的创制和新分子生化体系的开发。近期发表于Nature Catalysis。

为了开发酶的新型非天然转化体系，课题组以烯烃还原酶（ene-reductases, ER）为切入点，建立了可见光直接激发ER的新策略，并实现了一例烯烃的不对称自由基氢芳基化转化（图1）。ER是一类以黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）为辅因子的氧化还原酶，在自然界中可以完成C=C双键的双电子还原反应的催化。基于该酶，Hyster、Huimin Zhao、吴起以及徐鉴等，通过可见光激发电子供体-受体（EDA）络合物的策略，开发了一系列净还原的自由基反应体系（图1b）。但是，黄素类似物在合成化学领域是一类广泛应用于光氧化的催化剂。同时，自然界中存在的脂肪酸光脱羧酶的催化机制，经历的也是可见光直接激发黄素继而引发单电子氧化（图1a）。受此启发，作者提出了一种可见光直接激发ER、引发非天然自由基化学的新体系（图1c）。

图 1. 受自然启发的光酶的直接激发化学。图片来源：Nat. Catal.

作者首先设计了如图2所示的催化循环。烯烃还原酶结合的氧化态辅因子FMN_ox被蓝色LED激发，从基态到达激发态FMN_ox^*（Int. B）。激发态FMN_ox^*单电子氧化富电子芳烃，产生芳基自由基阳离子中间体以及半醌状态黄素辅因子FMN_sq（Int. C）。随后的自由基C-C键形成，生成前手性自由基中间体（Int. D）。最后，酶活性位点内的电子和质子（或氢原子）转移，生成对映体富集的产物，并实现辅因子再生（Int. E）。

类似上述酶促自由基过程，在自然选择过程中已被逐渐淘汰。究其原因，除了自由基反应固有的选择性控制难题，激发态的黄素蛋白还面临有很多的竞争途径。首先，可见光激发的醌态黄素容易被反应环境中的还原性物质或氨基酸残基还原（图2，路径b）。其次，非天然底物的单电子氧化过程必须足够高效，以竞争过无效的电子回转（图2，路径c）。第三，环境中游离的未结合黄素可能引起消旋背景反应。

图 2. 设计的催化循环。图片来源：Nat. Catal.

为了验证所设计的生物催化循环方案，作者选择了3-甲氧基噻吩和α-甲基苯乙烯作为模板底物，450-460 nm蓝色LED光照，发现几类烯还原酶可以以较低的反应性实现催化加氢芳基化。进一步研究发现，通过额外加入催化量的FMN作为添加剂，能够显著提高反应收率而不影响对映异构体选择性。经过条件优化和进化改造，作者发现葡萄糖酸杆菌来源的烯还原酶（GluER）可以实现对模板反应产率为81%的高选择性催化，产物具有（R）的选择性（97.5:2.5 er），而来自酿酒酵母的老黄酶突变体（OYE1-F296A）的产率为65%，具有（S）的选择性（95:5 er）。

接下来，对底物考察表明，该催化体系具有良好的底物适用范围和官能团耐受性（图3）。活化烯烃、内烯烃、非活化烯烃、以及各类的芳基底物，都能顺利发生反应（27例，最高达99%收率）。通过使用不同的酶，该体系能够分别获得产物的两个对映异构体，即实现立体发散式生物合成。同时，该反应可以以相同的效率和对映选择性放大到1 mmol级别。

图 3. 代表性底物。图片改自Nat. Catal.

随后，团队与中科大生命学院/中科院强磁场科学中心田长麟课题组以及厦门大学王斌举课题组合作，进行了一系列的机理研究。包括：1）紫外-可见吸收光谱鉴定可见光直接激发FMN的关键过程；2）低温电子顺磁共振（EPR）实验和自由基捕获实验证实了该反应涉及的相关自由基中间体；3）氘代实验探索了最后自由基终止步骤的氢来源；4）理论计算模拟解析了立体选择性的来源。详细内容请参考原文。

该论文第一通讯单位为配位化学国家重点实验室、化学和生物医药创新研究院、南京大学化学化工学院。南京大学2022级博士研究生赵贝贝、厦门大学博士研究生冯键强和中国科学院强磁场科学中心于璐副研究员为论文的共同第一作者。黄小强特聘研究员，以及王斌举教授和田长麟教授为论文的共同通讯作者。论文得到了南京大学启动经费、科技部重点研发计划（2022YFA0913000, 2019YFA0405600, 2019YFA0706900）、国家自然科学基金（22277053, 22121001, 21927814, 21825703）、江苏省自然科学基金（BK20220760）等项目的支持