单分子成像：实话讲，sCMOS真心倍儿香!

做成像的小伙伴大抵都了解，在单分子成像中，信号往往是极弱的，如何从背景噪声中pick出有效信号，是关键所在。为减小背景荧光（来自细胞的自发荧光等等）的影响，一般会采用“TIRF技术+科研级相机”进行成像。并较一般的成像应用，在灵敏度方面，单分子成像对相机的性能要求更为苛刻。

EMCCD相机在很长段时间里，都是单分子成像的心头好。一骑绝尘的量子效率（QE）外加电子倍增技能BUFF，妥妥站稳C位。除了贵，别的没什么毛病。

不过，随着sCMOS技术的持续发展，sCMOS相机稳步地立起了自己的山头。除拥有了更高的帧速、更多的像素数目、更高的分辨率，灵敏度/信噪比也得到了明显的提升。

滨松sCMOS相机（ORCA-Flash 4.0等第二代系列产品）从2015年左右开始，就逐渐被用于了STORM等基于单分子成像的超分辨技术应用中，以获得更高的帧速、分辨率。

滨松两款高端sCMOS相机与CCD相机的性能比较

而背照式sCMOS技术的出现，让sCMOS相机阵营又得到了一次飞跃。除了QE已达到与EMCCD相当的水平，受益于越来越低的噪声，信噪比也获得了进一步的提升。进而，对于单分子成像中信号较弱的场景，有了足够的灵敏度。一方面，成像质量几乎达到了媲美EMCCD的程度；一方面，价格较其还肉眼可见的成倍降低。

这性价比，就说，香不香吧！

拿滨松2020年发布的shou款背照式sCMOS相机ORCA-FusionBT来看。530万像素（2304x2304），配合6.5μm的像素尺寸，提供了出色分辨率；信噪比（SNR）方面，两个关键影响因素也做到了十分优秀的水平：QE高达95%，读出噪声低至0.7erms。

滨松背照式sCMOS相机ORCA-FusionBT

下面两个案例，可以看到这台背照式sCMOS在单分子成像中的优秀表现，特别是与EMCCD的成像对比：

案例 1

YFP标记的膜蛋白单分子TIRF成像

可见滨松ORCA-FusionBT sCMOS相机与EMCCD相机的成像效果对比。

案例 2

ORCA-FusionBT sCMOS相机的单分子成像案例

荧光探针为TagRFP，此案例采用了双色成像。

看到上面的成像效果，大家也就能体会到，单分子成像在相机选择上的“移情别恋”，也是必然的了。

而在第二个案例中，我们看到，该实验采用了双色成像。单分子成像经常与FRET技术联用，用于在单分子层面研究分子的构造变化（如蛋白质分子domain之间的距离变化等等）。

由于FRET技术需要对两个波长同时监测采像，所以一般会在相机和显微镜之间加装双色分光器，通过二向色镜/滤光片按照波长将信号分开，并分别成像。

针对这样的需求，滨松还可供“相机+双色分光附件”的双色同步成像方案。方案可分为单相机方案与双相机方案两种，前者成本较低，后者则有更大的视野范围以及更多扩展功能（如物镜后焦面成像、PSF修饰等）。

滨松双色分光附件W-View GEMINI系列

使用这套的双色成像方案的单分子FRET成像案例，可以参阅The bright future of single-molecule fluorescence imaging, Curr Opin Chem Biol. (2014) 20:103-111这篇文献。其中，作者采用滨松sCMOS相机与W-View GEMINI双色分光器配合，得到了zui高2ms时间分辨率的单分子FRET成像，分析了核糖体pre-translation complex的动力学结构变化。

Ok~单分子成像此次就聊到这里。而关于刚刚提到的单相机双色同步成像、双相机双色同步成像这两套方案，咱们就在下一期推文中，再为大家做详细介绍啦~欢迎关注~