干货分享 | RNA提取之吸光值比的奥义

完整性一般通过琼脂糖凝胶电泳判断，5SrRNA、18SrRNA和28SrRNA分子量大小不同，迁移速率不同，电泳条带上呈现5S、18S和28S三条条带，且28S正好是18S宽度的两倍，条带清晰明亮，就说明RNA的完整性较好（图1）。

图1（完整性较好的RNA琼脂糖）

而纯度和浓度则通过紫外分光光度计测量，核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰，而蛋白质含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，在280nm波长处具有最大吸收峰，盐离子在230nm波长处具有最高吸收峰，因此经常使用260、280、230nm下的吸光度分别代表核酸、蛋白质和碳水化合物、多肽、苯酚等有机物的值，通过260nm吸收值计算浓度，260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

一般认为OD260/280比值在1.8-2.0或者1.8-2.1之间的RNA纯度较好，但也会遇到不少OD260/280大于2.1的情况。我们先来看一张教科书式的RNA全光谱扫描图（图2）这里的OD260/280是2.15，但RNA仍然是完好没有降解的，也就是说理想状态下，100%纯度的RNA，或者说基本不残留蛋白的纯RNA， OD260/280比值是可以大于2.1甚至到2.2的，也证明了OD260/280比值超过2.1就是降解这个概念是需要重新审视的，单凭OD260/280容易误伤我们的劳动成果，是否真的降解，需要结合琼脂糖凝胶电泳，或者安捷伦模拟电泳图来确定。

图2（RNA全光谱扫描图）

图3（0.1mM 的胍残留导致OD260/230比值降低）

 图4（100mM的胍残留未抑制下游反转录/荧光定量的CT值）

RNA提取既基础又重要，通过以上介绍，相信大家已经对RNA的质控方法有了更全面的了解，在实践中更需要严谨地来对RNA进行质控，唯有更好的把控RNA 质量，我们才能识别真正因样品质量不好导致的后续实验失败，从而可以节省宝贵的时间、精力和成本，祝大家都能顺利完成实验。