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Topoisomerase I 助力5min完成克隆

来源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司      分类: 2023-11-23 00:00:00 22阅读次数
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拓扑异构酶(Topoisomerase) 是存在于细胞核内的一类酶,它们能够切断单链或双链DNA的磷酸二酯键,然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数,从而控制DNA的拓扑状态。DNA拓扑异构酶分为两类,I型DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase I)和II型DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase II)。
 
Topoisomerase I是由美国科学家Stewart Shuman在1990年从牛痘病毒中发现的,同时具有限制性内切酶活性和连接酶活性,能够在DNA复制过程中切断并重新连接DNA。Topoisomerase I可以在无需ATP供能的情况下切断DNA链,在切割单链DNA后,会与末端DNA片段形成暂时性中间体,并在释放压力后重新连接切口。由于Topoisomerase I具有切断、连接DNA的这种特性,常被用于克隆载体的构建(如TOPO克隆)以及NGS 建库中的接头连接等。

 

图1. Topoisomerase I原理图[1]

 

 
TOPO克隆
 
TOPO克隆是一种基于Topoisomerase I的PCR产物快速克隆系统,利用Topoisomerase I的连接原理,无需DNA连接酶,可在5 min内高效连接DNA片段。Topoisomerase I识别并切割TOPO载体上的结合位点,切割完成后,与TOPO载体结合形成复合物。目的DNA片段可在Topoisomerase I的作用下与TOPO载体连接,形成克隆。
 

技术路线

 

识别切割:Topoisomerase I识别DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’,并且能够在该位点对DNA进行切割;

 

固定:Topoisomerase I借助DNA断裂的能量将酪氨酸残基与载体DNA 3’末端形成共价键,从而固定在DNA载体上;

 

连接:在加入目的DNA片段(PCR Product)后,目的DNA片段的5'端羟基攻击载体片段的磷酸键,释放能量,使得目的DNA片段的 5'端羟基与载体片段的3'端磷酸基团连接在一起;

 

脱落:Topoisomerase I从载体分子上脱落。

 

图2. TOPO原理图

 

 
翌圣Topoisomerase I
 
翌圣Topoisomerase I (Cat#14971ES)由翌圣镁孚泰生物ZymeEditor酶进化平台经过重组表达获得,无外切酶残留、低宿主残留,可应用于NGS 建库中的接头连接、TOPO克隆等!

 

 
部分数据展示
 
01

 

应用到TOPO克隆,克隆效果优于A品牌

 
 
使用不同批次的Topoisomerase I进行TOPO克隆,分别连接2 kb的粘性末端、4 kb的平末端,实验结果表明,翌圣Topoisomerase I运用到TOPO克隆中,克隆效果优于A品牌,阳性克隆率达100%(8/8)。

 

图3. Topoisomerase I运用到TOPO克隆效果图

 

02

外切酶残留

 
 
将50 U不同批次的Topoisomerase I分别与相应的底物DNA在37℃孵育4 h,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,翌圣Topoisomerase I无外切酶残留。

图4. 外切酶残留检测

 

03

E. coli基因组DNA残留< 1 copy/5U

 
 
对不同批次的Topoisomerase I (Cat#14971ES)进行E. coli基因组DNA残留检测,结果显示翌圣Topoisomerase I宿主基因组DNA残留远低于1 copy/5U。

图5. E. coli基因组DNA残留检测

 

 

 
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产品名称

产品货号

产品规格

Topoisomerase I

14971ES

100 / 500 U

 

 

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最近更新:2024-12-18 14:04:41
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