涨知识 | 克隆专题八：一步法快速克隆FAQ——常见问题解答

2023-12-12 00:00:00 20阅读次数

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克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。

大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。因为步骤较多且知识点复杂，在实验的过程中就会遇到各种各种的问题，尤其是各位科研儿们运用最多的同源重组技术。接下来小翌会具体解答一下同源重组中常见的问题，为您的实验提供好方法。

一步法快速克隆试剂盒运用到的分子克隆技术是什么？

翌圣Hieff Clone^®系列一步法快速克隆试剂盒运用的是Gibson Assembly同源重组技术，其使用的同源重组酶兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性和连接酶活性。

外切酶活性：该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的15-25 bp的同源序列，并沿着5';→3';方向切割dsDNA，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将片段和载体的5’末端都降解成一样长的粘性末端，同源末端退火配对后，还存在单链的碱基缺口。故需要借助DNA聚合酶活性进行修复。
连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口缝合。

图1.同源重组原理

与传统分子克隆相比，一步法快速克隆试剂盒有什么优势？

应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变；

设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入15-25 bp与载体末端同源的序列即可。

小翌在这里给大家推荐一款翌圣新品，通用型多片段一步法快速克隆试剂盒（Cat#10923ES），该产品连接效率高，菌落数多，小体系连接不仅省酶，也省片段/载体！

一步法克隆试剂盒连接反应总体系20 μL，但载体/片段浓度低可否使用小体系连接？

可以。翌圣通用型多片段一步法快速克隆试剂盒10923ES，经过大量的内部测试和市场验证，连接反应总体系可以低至6 μL，小体系连接效率高，上市至今客户反馈使用效果好！

小体系高效率重组

实验信息：载体大小：5369 bp；目的片段大小：1589 bp。

实验数据：

图2. 10923ES在10 μL小反应体系下，低浓度载体（30 ng）连接单片段，阳性率100%。A：重组转化平板。B：插入片段PCR鉴定电泳图，泳道1-5分别为菌落1，菌落2，阴性对照，阳性对照（基因组作为模版），阳性对照（PCR纯化片段作为模版）。（上海交通大学）

小体系高效率重组

实验信息：载体大小：1600 bp；目的片段大小：1000 bp。

实验数据：

图3. 10923ES在10 μL小反应体系下，阳性率高。A：重组转化平板。B：插入片段PCR鉴定电泳图。（武汉大学）

小体系长载体高效率重组

实验信息：载体大小：10000 bp；目的片段大小：1011 bp。

实验数据：

图4. 10923ES在10 μL小反应体系下，低浓度长载体（50 ng）连接单片段，阳性率高。A：重组转化平板。B：插入片段PCR鉴定电泳图。（河南农业大学）

超短片段高效率重组

实验信息：载体大小：5000 bp；目的片段大小：72 bp。

实验数据：

图5. 10923ES连接72 bp超短片段（20 ng），菌落数多于竞品，阳性率高。A：重组转化平板。B：插入片段测序鉴定图。（浙江大学）

多片段高效率重组

实验信息：载体大小：5400 bp；目的片段大小：1500 bp，66 bp。

实验数据：

图6. 10923ES在低浓度载体（45 ng）下连接二片段，菌落数多，阳性率高。A：重组转化平板。B：插入片段测序鉴定图。（中国科学技术大学）

一步法克隆连接后无阳性克隆或者菌落数少，是什么原因造成的，该怎么解决呢？

详细阅读下表，为您提供解决方案~

出现问题	原因分析	解决方法
无克隆长出或克隆数较少？	原因1：引物设计错误	①设计原则：同源臂（15-25bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物（常规插入片段扩增引物）。 ②判断方法：使用翌圣无缝克隆引物设计软件核对（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）。
	原因2：线性化载体与目的片段使用量错误	线性化载体与目的片段添加比例：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，最适载体使用量为0.03 pmol；最适目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。注：a、片段长度大于载体时，最适载体与目的片段使用量的计算方式应互换，即目的片段当做载体，载体当做目的片段进行计算。 b、线性化载体的使用量应在50-200ng之间；目的片段扩增产物的使用量应在20-200ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。
	原因3：载体与目的片段不纯	推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入，故DNA纯化产物不能使用TE进行DNA保存，可溶解在pH8.0的ddH₂O中保存。未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过反应体系体积1/5。
	原因4：操作问题或试剂盒失效	推荐做试剂盒自带的阳性对照实验，若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人进行阳性对照实验，进一步排除是否为操作问题。
	原因5：感受态细胞效率低，＜10⁷cfu/μg	转化效率检测方法：转化0.1ng质粒（如PUC19），生长1000个菌斑，估算转化效率为10⁷cfu/μg。
假阳性—不含插入片段（空载）？	原因1：载体线性化不完全	判断方法：将已制备的线性化的载体转化涂板，如果长克隆较多，则表示线性化不完全。解决方案：若线性化不完全则需优化酶切体系，例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。
假阳性—不含插入片段（空载）？	原因2：反应体系中混入了相同抗性的环状质粒	判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。解决方案：PCR扩增产物先用DpnI消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。
假阳性—含不正确的插入片段？	原因1：PCR产物混有非特异扩增产物	可能情况：PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。解决方案： ①优化PCR体系，提高特异性； ②胶回收PCR产物； ③鉴定更多的克隆。
假阳性—含不正确的插入片段？	原因2：片段缺失	可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI，VectorNTI等）。
菌落PCR无目的条带？	原因1：菌落PCR引物错误	推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
	原因2：PCR试剂Mix不稳定，PCR体系或程序不合适	①更换新的PCR试剂盒 ②优化PCR体系、程序； ③提取质粒，以质粒做模板PCR验证； ④换成质粒酶切鉴定阳性克隆。
	原因3：载体线性化不完全	可能情况：目的片段引物+一端载体通用引物，或另一端目的片段引物扩增无产物，而载体通用引物扩增有产物，且大小符合空载。解决方案：优化酶切体系。例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。
测序后插入片段有缺失或者突变？	原因1：PCR扩增试剂的高保真性不强，导致位点缺失或突变	快速克隆试剂盒作用于15-25 bp的同源臂上，不会导致片段中间的位点缺失或者突变。解决方案：更换保真性更高的PCR扩增试剂盒
测序后插入片段有缺失或者突变？	原因2：在切胶回收过程中，紫外下切胶过久导致突变	减少切胶时间，避免胶长时间暴露于紫外光下。

以上，就是一步法快速克隆试剂盒的FAQ，请您查收~再加上您的细心、耐心与恒心，做实验必定事半功倍，一气呵成！

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产品定位	产品名称	产品货号	规格
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