血清 4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量 PCR 诊断技术

本标准所规定的血清4型Ⅰ群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型Ⅰ群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型Ⅰ群禽腺病毒核酸的检测。

实验室要求

环境

实验室符合GB19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。

从事PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。

生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做处理。

人员

操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。

仪器设备

生物安全柜。

PCR仪(温度差小于0.3 ℃)。

台式低温高速离心机(转速为15000 rpm)。

电泳仪。

电泳槽。

紫外凝胶成像仪。

冰箱：2 ℃～8 ℃。

冰柜：-20 ℃。

微量移液器(量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL)，带滤芯的枪头。

电子天平：精度为0.001 g。

电磁炉或微波炉。

荧光定量PCR仪。

样品采集与运输

采集疑似血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染死亡家禽的肝脏、脾 脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理;活禽采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4 ℃，时间不超过24 h。

脂糖凝胶电泳

PCR反应结束后，取9 μL样品与1 μL核酸电泳加样缓冲液混匀后，与1.0%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳30 min。电泳后，置于凝胶成像仪观察，根据分子量标准判断PCR扩增产物大小。

实时荧光定量PCR反应

实时荧光定量PCR反应体系

Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL，Rox Reference Dye II 0.2 μL，引物1983F(100 μmol/L)和引物2068R(100 μmol/L)各0.4 μL，探针P(100 μmol/L)0.4 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。反应液混匀后置于ABI 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。

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