Jess Superplexing技术:3μL样本实现多重定量Western Blot

       传统的WesternBlot，耗时长，手工操作多，重现性差（CV>35%）。遇到珍惜样本，蛋白量不足时：无法进行蛋白质多靶点分析，不能实现分子机制的深入研究。

Jess全自动定量Western Blot的特点：

• 只需3μl样本(分选干细胞、免疫微环境细胞、珍稀临床样本等）

• 四通道：化学发光、双色红外荧光、总蛋白检测通道

• 全程4小时：实现靶蛋白、靶蛋白磷酸化、样本总蛋白检测

• 定量数据

       ProteinSimpleZxin发布的 Jess Superplexing Application Note中，利用Jess的不同的检测通道（化学发光，双色红外，样品总蛋白），以总蛋白作为loading control进行靶点蛋白的相对定量，评估p-Akt和总Akt水平。在3μL样本，实现p-Akt, Akt和相对于总蛋白的相对定量。

       总蛋白作为LoadingControl将会取代传统的内参蛋白。

Jess全自动多通道定量Western Blot Superplexing检测原理

       Jess检测顺序：首先检测样品中总蛋白质信号，接着进行双色红外荧光western blot，Z后进行化学发光Western Blot。单次实验结束，获取：总蛋白结果，双色红外荧光western blot结果，化学发光western blot结果。

Jess Supleplexing实验举例

       实验设计：

       样品分为两组：Jurkat或Jurkat + Calyculin A（Calyculin，PP1/PP2A的YZ剂。可以诱导Akt产生磷酸化）。

       样品量：各3μL

       多通道检测：

       Ø  化学发光检测：p-Akt

       Ø  NIR检测：总Akt

       Ø  总蛋白检测通道（完全独立于其它两种检测通道）：总蛋白（作为loading Control）

       结果：

1.    多种数据模式同时提供（传统western blot 条带图，积分峰形图，原始定量数据）

2.   Jess总蛋白归一化功能，将总蛋白作为内参，体现可比数据的真实性

       不种浓度（0.4, 0.6, 0.8mg/ml）的Jurkat+Calyculin A的全细胞裂解物的原始数据（橙色条），和做过蛋白归一化校正后的（蓝色条）相对定量值。

       两个靶点p-Akt（图A）和总Akt（图B）。

       随着Jurkat + Calyculin A裂解物的浓度增加，p-Akt表达的原始数据增加（图A，橙色条）。但是，归一化后的结果说明，所有三个不同浓度Jurkat + Calyculin A样品中检测到了类似水平的p-Akt（图A，蓝色条形），即p-Akt水平并不会随着上样裂解物浓度的增加而增加。

       样本中蛋白质磷酸化的水平不会随上样浓度改变而改变。

       这些数据说明，如果没有总蛋白作为内参进行校正，会得到不真实的数据结果。

小结：

       Jess Superplexing技术在同时使用化学发光和双色红外荧光通道，仍然可以通过独立通道检测各个样品的总蛋白。它的多通道使用功能可以对少量样品（3μL），获得尽可能多的数据，且只需Z少的动手时间即可完成实验设置和数据分析。

       欢迎使用全自动多通道定量Western Blot技术：Jess Superplexing！

参考文献：

1.Akt regulates cell survival and apoptosis at a postmitochondrial level, H Zhou, XM Li, J Meinkoth and RN Pittman, Journal of Cell Biology, 2000; 151(3):483-94.

2. The protein kinase PKB/Akt regulates cell survival and apoptosis by inhibiting Bax conformational change, H Yamaguchi and HG Wang, Oncogene, 2001; 20:7779-86.

（来源：ProteinSimple）