膜蛋白，核蛋白和胞质蛋白抽提方法

膜蛋白，核蛋白和胞质蛋白抽提方法

一、产品简介:
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取膜蛋白，核蛋白和胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的膜蛋白，核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(Gel Shift Assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究，可以用于培养细胞或动物组织中蛋白质的提取。每次可以处理107个细胞或200mg动物组织，由溶液溶液A，溶液B，溶液C，DTT，蛋白酶YZ剂，磷酸酶YZ剂，PMSF组成，可以使用50次。

二、产品特点：
1. 提取的蛋白Zda限度地保持活性，可以用于Pull Down,EMSA,IP，Enzyme Activity Assay等实验。
2. 内含有的蛋白酶和磷酸酶YZ试剂可以避免蛋白质的酶解和蛋白质磷酸化状况被破坏。
3. 整个实验过程只需要一个小时左右。无需要超速离心，可以并行处理多个样本。
4．即可以用于培养细胞（50x107个），有可以用于动物组织（50x200mg）蛋白质的提取。

三、试剂盒组成：
溶液A 80ml
溶液B 30ml
溶液C 30ml
DTT 150ul
蛋白酶YZ剂 150ul
磷酸酶YZ剂 750ul
PMSF 1500ul

四、运输和保存条件：
常温下运输，收到后将溶液B 2-8度保存，DTT，溶液A, C和蛋白酶YZ剂，PMSF和磷酸酶YZ剂在-20度的环境中保存，保质期一年。

五、操作步骤：
1． 对于悬浮培养的细胞，取培养细胞5×106～1×107个，弃去培养液，细胞用预冷的一倍PBS洗涤两遍。
2. 如果是组织样本，将200mg组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS洗涤两次后，4℃离心700×g，3 min，弃上清。
3. 将以上收集的细胞或组织中加入1000μL预冷的溶液 A【使用前每1mL 溶液 A加入1μL DTT，10μL PMSF，1μL蛋白酶YZ剂和5ul磷酸酶YZ剂】，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次，或超声破碎细胞，每次30 S ， 3～4次，每次间隔1 min， 置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％。
4. 涡旋震荡10s，冰上放置20分钟，期间取出震荡3-5次,再于4℃, 12000 rpm 离心10 min，上清为胞质蛋白部分，分装并保存于-80℃，避免反复冻融。
注意：对于沉淀，可以用250ul 的溶液A进行清洗1-2次，再进行步骤5，以减少残留的胞质蛋白对下游提取的污染。
注意：为减少膜蛋白和核蛋白对胞质蛋白的污染，可以将步骤4中的离心时间延长到20-30分钟。
5. 在沉淀中加入500ul预冷的 溶液B【使用前每1mL 溶液 B加入1μL DTT，10μL PMSF，1μL蛋白酶YZ剂和5ul磷酸酶YZ剂】,涡旋震荡10s，在冰上放置10分钟, 期间取出震荡2-3次，再4℃，12000rpm, 离心10min，取上清，作为核蛋白部分，分装并保存于-80℃，避免反复冻融。
注意：对于沉淀，可以用250ul 的溶液A进行清洗1-2次，再进行步骤6，以减少残留的核蛋白对下游提取的污染。
注意：为减少膜蛋白对核蛋白的污染，可以将步骤5中的离心时间延长到20-30分钟，以便于膜蛋白的充分沉降。
6．在离心沉淀物中加入500μL预冷的 溶液C (使用前每1mL 溶液 C加入1μL DTT，10μL PMSF，1μL蛋白酶YZ剂和5ul磷酸酶YZ剂)，Zda转速涡旋剧烈振荡10s，超声破碎10秒,再置于摇床中冰浴10min, 期间取出震荡2-3次。
7．4℃，12000rpm, 离心10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得膜蛋白；分装并保存于-80℃，避免反复冻融。

六、注意事项：
1． 所有的试剂及器具均需预冷后使用，以保证蛋白质的完整性。细胞或组织量需达到要求。
2． 因为不同蛋白质和不同的实验，所需要的缓冲体系不同，提取后的蛋白质样品,特别是核蛋白，如有必要，可透析除去其它一些盐份。
3. 可以使用（BSP090 ）Sephadex 重力型脱盐柱脱盐或将缓冲液替换为实验所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。
4．对提取的膜蛋白和核，胞浆蛋白，可以采用我公司生产的非干扰型蛋白质浓度定量试剂盒（SK3071）或改良型Lowry法蛋白质浓度定量试剂盒（SK4041）或改良型BCA法(SK3051)对提取样品中的蛋白质进行定量.
5．如果用于蛋白质质谱研究，请用请用我公司生产的铜染（BSP017）或锌染（BSP019）或质谱用快速银染试剂盒(BSP021)对胶上的蛋白质进行染色，这些染色方法对蛋白质没有修饰作用，所以对质谱图没有影响。对于一般的染色，可以采用无毒型考马氏亮蓝染色液（SK3011）或高灵敏考马氏亮蓝染色液（BSP041）进行染色。
6．使用后，请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气的物质发生化学反应。
7.本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、ZL和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。