来自马萨诸塞州总医院研究团队的研究成果刊登于2024年年初Cell Reports Methods中，作者使用piggyBac转座子递送CRISPR文库从而建立了新的的突变模型构建方法。
新技术和大规模队列研究使新的变异株能够在未经证实的范围内发现和关联，但这些变异株的功能特征对于破译疾病仍然至关重要。有助于对感兴趣的细胞或诱导多能干细胞（iPSC）并行基因编辑的方法已经成为实现这一目标的关键工具。本文中，作者开发了一种方法，将CRISPR-Cas9 guideRNAs（gRNA）文库和诱导型Cas9一起整合成一个piggyBac（PB）转座子系统，构建数十到数百个基因组突变体。这种方法通过引入插入或缺失（indel）和拷贝数变异（CNVs），尽管产生特定的核苷酸变化可以进行原始编辑。大规模快速建立高质量突变模型的能力将有利于等位基因细胞集合的建立，并催化研究数百个基因和突变在发育和疾病中作用的比较功能基因组研究的发展。
▲用于并行化基因组工程的PB系统
示意图概述了PB系统实验工作流程。（上）将gRNA文库克隆到PB质粒载体中。（中）通过PB转座子细胞传递和移除CRISPR组件可实现多因子、时间控制编辑。（下）分离单细胞建立克隆化iPSC细胞系，使用MIPs进行基因分型以鉴定突变模型。
本文的方法学中，专门提到利用流式进行96孔板的单细胞分选，用于克隆的形成和筛选。作者使用了多种不同细胞分选设备、孔板包被基质和克隆形成培养基的组合，最终发现最有效的分选组合使用了Bigfoot全光谱流式细胞分选仪将单细胞分选进包被 rhLaminin-521和含有10% CloneR2 cloning supplement的培养基的方案。分选后的细胞经过单克隆培养，单克隆DNA提取进而进行WGS分析。
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