前沿应用｜Bigfoot流式分选仪助力CRISPR/Cas基因编辑方法学研究

CRISPR/Cas系统已成为代谢工程和人类基因治疗中基因组编辑的强大工具。然而，使用CRISPR/Cas系统在染色体上定位整合异源基因的最佳位点仍然是一个悬而未决的问题。

选择合适的基因整合位点需要考虑多种复杂的标准，包括与CRISPR/Cas介导的整合、遗传稳定性和基因表达相关的因素。因此，在特定或不同的染色体位置上识别这些位点通常需要大量的表征工作。

为了应对这些挑战，研究人员开发了CRISPR-COPIES，这是一种用于识别CRISPR/Cas促进的插入位点的计算机流水线。该工具利用ScaNN（一种基于嵌入的最近邻搜索的最先进模型，用于快速准确的脱靶搜索），可以在几分钟内识别大多数细菌和真菌基因组的全基因组基因间位点。作为概念验证，我们利用CRISPR-COPIES来表征三种不同物种中的中性整合位点：酿酒酵母、杀虫贪铜菌Cupriavidus necator和HEK293T细胞。研究人员预计，CRISPR-COPIES将成为靶向DNA整合的有价值工具，有助于合成生物学工具包的表征，能够快速构建菌株以生产有价值的生化物质，并支持人类基因和细胞治疗应用。

流式细胞术显示成功分离出HEK293T细胞系中GSH位点的EGFP阳性亚群：Rogi1、位点1、位点3、位点4和位点5。进行多轮（四至五轮）FACS，直到EGFP阳性细胞的百分比超过90%。

流式细胞术证明，使用多轮细胞分选成功分离出EGFP阳性的GSH位点亚群：Site2和Site6。以群体中EGFP阳性细胞的比例测量的整个群体的平均EGFP荧光强度和整合稳定性。在分离表达EGFP的同质亚群60天后，研究人员持续监测转基因表达水平。