- 2025-01-21 09:33:16细胞系构建
- 细胞系构建是指通过特定方法从原始细胞或组织中培养出具有稳定遗传特性和生物学功能的细胞群体的过程。这些细胞系常用于生物学、医学研究及药物筛选等领域。构建过程中需确保细胞纯度、增殖能力及功能特性，常涉及细胞分离、培养条件优化及遗传操作等技术。细胞系的成功构建为疾病机制的探索、治疗方法的开发提供了重要工具。
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细胞系构建问答
- 2023-06-16 14:28:25构建表达载体想降本增效？看这一篇就够了
- 想要开发有稳定生产能力的细胞株，除了在细胞开发中对于细胞表达能力的评估筛选以外，前期的表达载体的构建过程也非常重要。使用纳升移液技术可以显著提高细胞株过程基因合成，表达载体构建以及转染筛选等实验的实验效率，降低实验成本。声波移液展示Echo®移液系统依靠专 利技术（U.S. Patent 6938995）和创新方法改变移液操作在整个生命科学领域中的应用。它采用动态液体分析（Dynamic Fluid Analysis™, DFA）技术和声波移液（Acoustic Droplet Ejection，ADE）技术，让研究人员能够移取多种不同类型的液体，完成微量小体积（2.5/25nL）的移液工作。全流程无需枪头耗材，无交叉风险。纳升移液技术让细胞株构建更快、更准、更经济更快—— Echo快速任意孔到任意孔移液，极速基因组装在质粒构建前期，需要非常多的准备实验，如基因组装中将不同的DNA片段混合，在检测反应中将不同的样本组合，在NGS文库构建过程中将多个文库pooling到一起，在CRISPr基因编辑中构建sgRNA文库等等，这些实验都需要进行快速、灵活的加样移液，就算使用高通量的移液工作站，往往也要好几小时才能完成。纳升移液技术Echo的任意孔到任意孔的快速移液特点则让此类应用简单、快速化，每次转移花费更少时间更短。这为基因组装节省了高达82%的时间。从母板任意孔转移任意体积样品到目标板任意孔中，实现快速挑选、样品混合和组合。有效缩短实验周期更准—— Echo加样精 准，提高克隆效率利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，需要对筛选结果进行鉴定， 而qPCR也是常用的鉴定方法之一。使用Echo纳升移液技术进行微量化克隆筛选鉴定，可以以更少的实际成本精 准完成实验。使用Echo完成 qPCR的反应体系构建，通过减少每个组件的体积，并使用不使用tips的Echo，将反应体积缩小10倍，从10 μL减少到1 μL，成本降低了8倍。精 准减小实验体积更经济—— Echo微量化，缩小反应体系，让新技术更经济系统化的设计必然会带来更大的样本量，从而导致更高的费用， Echo采用声波的能量进行无接触式移液，且每滴液滴仅为2.5nL或25nL，因此可以直接省去吸头耗材的消耗，也可以将检测反应体系降低4-100倍，使成本急剧下降。有效缩减试剂成本Gibson and Golden Gate Assembly实验：不同反应体积的成本效益和组装效率比较产品信息“仅用于科研，不用于临床诊断”
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- 2022-11-21 10:19:06“沃”的实验 | 13份动物模型构建方法系列资料上新，造模不再难！
- 在做基础研究时加入动物实验不仅会使研究工作更完善，也会提高投稿的命中率，但是想把实验做成功却不是件容易的事儿，因为在动物造模中总遇到各种难题：搞不清动物建模标准化的流程，做起实验磕磕绊绊造模需要注意的细节多，反复摸索十几遍才造模成功明明按照文献中的实验方法造模，却还老是不成功“沃”的实验全网最全的生命科学研究线上学习平台第二期内容：常见疾病动物模型——构建方法系列2帮助大家解决造模中遇到的难题第二期内容有什么？“沃”的实验——全网最全的生命科学研究线上学习平台第二期内容，为大家分享常见疾病动物模型构建方法，涵盖8大视频课程+2大实验手册+3大建模的标准操作流程。5位老师线上为你讲解不同动物模型的背景、造模方法等内容，理论结合实践，希望能给大家的动物建模带来更多新思路和新灵感。点击链接，即可进入学习 8大视频课程 2大实验手册 3大建模的标准操作流程欢迎大家收藏「“沃”的实验」线上学习平台学习平台，内容将持续更新下期内容预告： 实验动物手术操作-手术方法
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- 2022-04-18 13:45:53Neuron：北大李毓龙课题组构建一种全新的ATP荧光探针
- 文章概述三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一种广泛存在于体内的能量存储分子。除了参与细胞内的能量代谢功能外，越来越多的证据表明，释放到细胞外空间的ATP可以作为一种分子信号（嘌呤能递质），能够结合并激活离子型P2X受体以及代谢型P2Y受体。在神经系统中，释放的ATP参与了多中生理病理过程，包括痛觉感受、机械/化学感知信号转导、突触传递、损伤、炎症等。对于ATP在这些生理过程中的作用，目前的研究并未完全阐明。为了进一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大学生命科学学院李毓龙教授团队发表在《Neuron》期刊上发表题为“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究论文，该项工作展示了团队最新开发的一种可遗传编码的荧光分子探针——GRABATP1.0（简称ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），该探针以P2Y受体作为ATP的结合支架，能够对细胞外的ATP进行高灵敏度、高选择性以及高时空分辨率的实时测量。该项工作是李毓龙教授团队在相继开发了乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探针之后的后又一重要成果，对于我们深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意义。核心观点1、ATP1.0是一个可遗传编码的细胞外ATP感受器；2、ATP1.0对于细胞外ATP具有高敏感性和高时空分辨率；3、ATP1.0可用于离体以及在体ATP释放的实时监测。研究结果分析1. ATP1.0表现出卓越的细胞外ATP检测性能为了开发一个遗传编码的ATP荧光探针，研究者首先系统地筛选了能够被ATP激活的G蛋白耦合受体（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以这些GPCRs作为支架，研究者将结构敏感的绿色荧光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到这些受体结构中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表现出最佳的膜转运和对ATP的响应性，因此随后研究者选择了基于hP2Y1的嵌合体ATP0.1进行进一步优化，并且最终得到了对ATP荧光响应性最 好的ATP1.0。当ATP1.0在HEK293T细胞中表达时，它能够很好的被运输到细胞膜上表达，并对细胞外100mM的ATP产生一个~500%的dF/F0峰值。在特异性方面，ATP1.0对细胞外ATP的反应能够被P2Y1的拮抗剂MRS-2500阻断。ATP1.0对其它递质不会产生反应，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、血清素、组胺和乙酰胆碱等，对二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反应与ATP类似，但是对于其它结构类似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等几乎不产生反应。ATP1.0的反应具有快速动力学的特征，其反应平均上升时间常数约为28 ms，平均衰减时间常数约为283 ms。在荧光强度上，ATP1.0被ATP激活时的亮度达到了直接表达hP2Y1-EGFP融合蛋白荧光强度的64%，并且ATP1.0在单光子激发下的光谱与EGFP相似，激发峰在500 nm，发射峰在520 nm。在与其它细胞外ATP分子探针的比较中，ATP1.0表现出更大的动态检测范围、更强的荧光反应、以及更低的信噪比。接下来，研究者探讨了ATP1.0在原代培养的星形胶质细胞和神经元中的表达能力以及反应性。ATP1.0能够广泛的表达到星形胶质细胞和神经元的细胞上，包括胞体、突起等部位。表达到星形胶质细胞和神经元上的ATP1.0对细胞外ATP均有较好的反应，其平均dF/F0峰值分别约为1000%和780%。此外，ATP诱导的荧光反应也能够被P2Y1、受体拮抗剂MRS-2500阻断。此外，与HEK293T中结果相似，神经元中表达的ATP1.0对ATP和ADP均有反应，但对一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均无反应。更重要的是，ATP1.0在细胞表面非常稳定，在给予10mM 的ATP 两小时后，表达ATP1.0的神经元的荧光没有出现明显下降。综上所述，ATP1.0能够适用于多种类型的细胞，对细胞外的ATP产生高灵敏度、高选择性和高稳定性的荧光增强反应。2. ATP1.0可用于监测体外培养细胞外的ATP水平接下来，研究者测试了ATP1.0是否能够用于检测神经-胶质共培养细胞中内源性ATP的释放。在大脑中，机械刺激和细胞肿胀均能诱发胞内ATP被释放。在表达ATP1.0的细胞中，给予细胞机械刺激（利用玻璃微电极按压某个细胞），能够引起一个快速、局部增强的dF/F0信号，反映了ATP的释放。为了诱导细胞肿胀，研究者将细胞浸泡在低渗溶液（130 mOsm/kg）中;在1min内，dF/F0信号显著增加。并且在应用MRS-2500后，这两种刺激引起的反应都被完全抑制。研究者还发现，低渗刺激诱导的ATP释放可能不需要依赖经典的SNARE囊泡释放机制，因为细胞表达了破伤风毒素轻链（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突触短肽并阻止胞外分泌过程），但是对低渗刺激诱导的反应没有影响；而作为对照，表达TeNT阻断了低渗刺激诱发的谷氨酸释放。除了刺激诱发的ATP释放外，研究者还观察到，即使在没有外部刺激的情况下，神经-胶质共培养细胞中也存在自发、局部、以及短暂的ATP1.0信号。在1.6mm2成像视野中，这些自发事件以1.2次/min的速率出现，其dF/F0的平均峰值约为210%。ATP自发释放的平均上升时间约为11s，衰减时间约为43s，其释放范围的平均直径约为32mm。为了确保ATP1.0信号反映了细胞外的ATP动态变化，研究者利用三磷酸腺苷双磷酸酶（ATP的水解酶）对细胞进行处理并成像，观察到三磷酸腺苷双磷酸酶能够显著阻断自发事件的发生。与以前的检测手段相比，ATP1.0具备更高的灵敏度，能够在普通条件下特异性的检测ATP的释放。3. ATP1.0可用于监测斑马鱼幼体中ATP的动态变化在证明了ATP1.0可用于体外ATP的检测后，研究者接着探讨了它是否可以用于监测体内（如斑马鱼中）ATP的动态变化。在斑马鱼幼体神经元中特异性地表达ATP1.0后，利用ATP局部处理会引起视顶盖中dF/ F0信号出现强烈的瞬时增加，这些信号能够被MRS-2500阻断。在验证了ATP1.0能够对外源ATP做出反应后，研究者进一步探讨了ATP1.0是否能够用于检测活斑马鱼内源性ATP的释放。ATP信号在促进小胶质细胞向损伤部位迁移中发挥关键作用。在表达ATP1.0的斑马鱼中，研究者发现激光消融诱导视顶盖损伤后会导致荧光增强，其反应从损伤部位向外呈放射状传播。损伤后11s和64s释放ATP的范围，其平均直径分别为~23mm和~34mm。接下来，研究者通过在斑马鱼的视顶叶中表达ATP1.0，同时监测ATP的释放和小胶质细胞的迁移，斑马鱼的小胶质细胞用红色荧光蛋白DsRed标记。研究者们发现，在激光消融后，小胶质细胞沿着ATP传播路径逐渐迁移到损伤部位。因此，ATP1.0非常适用于活体斑马鱼幼虫ATP监测，并且具有较高的时空分辨率。4. ATP1.0可用于监测小鼠全身炎症引起的ATP局部释放ATP是应对机体急慢性炎症反应的关键细胞外信使，但是在全身炎症期间ATP释放的模式还不清楚。研究者在小鼠腹腔注射细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导全身炎症，并通过双光子显微镜来观察直接观察视觉皮层ATP1.0的荧光反应。注射LPS 24小时后，研究者观察到皮质内多次ATP局部释放事件，在记录的20min内，其发生频率约为5 – 10次/min。在星形胶质细胞中，ATP释放的上升时间相对较快（
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- 2022-05-19 15:21:24线栓法构建的局灶性脑缺血模型，你会么？
- 为什么要构建局灶性脑缺血模型？世卫组织《2020全 球卫生估计》统计显示，2019年10大死亡原因中有7个是非传染性疾病。其中，中风是第二大死亡原因，占总死亡人数的11%。中风，又称“脑卒中”、“脑血管意外”，是一种急性脑血管疾病，包括缺血性和出血性卒中，其中缺血性脑血管病占60-70%。缺血性脑血管病严重危害人类的健康，建立一种与人脑梗塞类似的动物模型使之适合溶栓治疗研究具有重要的研究意义和实用价值。卒中又名大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），是一种局灶性脑缺血模型，也是目前应用最广泛的脑缺血模型。其发病机理与人类缺血性脑卒中表现相似，对于制作模拟人脑缺血模型对脑缺血发病机制及药物筛选有重要意义。如何构建局灶性脑缺血模型？构建局灶性脑缺血模型方式有很多种，栓塞法、线栓法及光化学方法等。小沃今天就教你如何运用 线栓法 建立一个完美的局灶性脑缺血模型。认识线栓法Koizumi于日本卒中会议(1985)首次报道了可逆性MCAO模型，解决了大鼠局灶脑缺血再灌流损伤研究的难题。分离暴露颈部血管，从ECA或CCA分叉处插入4～0尼龙线，进入ICA，阻断MCA起始端及其所有侧支血液供应，导致MCA区局灶缺血。一定时间后轻轻提拉插线，有阻力时提示丝线头端已达ECA或CCA切口处，制做成再灌流模型，不需再次切开颈部。线栓法分类目前该模型具有代表性的方法有两类，即Longa法川和Koizumi法。前者是把尼龙线头端烧成球形，后者在尼龙线远端徐一层硅酮弹性体（长度5 mm，直径0.25 mm），便于插入ICA并胀紧血管。Laing对上述两种方法做了对比研究，发现两者脑缺血中心区细胞坏死和脑血流改变相差显著，Koizumi法闭塞效果更好。线栓法优点线栓法的优点在于模型制作不用开颅，MCAO效果也比较理想，是目前普遍使用的能观察再灌流损伤的局灶性脑缺血模型。线栓法实操详细解说用线栓法建立局灶性脑缺血模型的每一个流程，长按图片还可直接保存流程图。图文演示，让你的动物实验不再困难。
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- 2022-06-21 17:34:18“沃”的实验 | 免费直播！脑缺血模型构建及检测，助你快速掌握要领！
- 实验动物该怎么选择？不同脑缺血模型，弄不清对应构建方法？常用的血流监测技术，你都掌握了吗？「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程直播第五期为大家聚焦《脑缺血模型构建及检测》从实验动物的选择、不同模型的分类各个模型的构建方法到血流监测技术两位老师将进行综合详细的讲解全面助力你的科研实验研究直播时间6月21日（周二）19：00报名方式识别上方二维码，立即免费报名主题：脑缺血模型构建脑缺血研究背景脑缺血动物模型构建脑缺血模型构建实验仪器讲师：孙绍强瑞沃德行业解决方案专家，在膜片钳/钙成像/干细胞诱导方面有着丰富的实验经验，曾参与多项重大研发及自然科学基金项目，曾在Cell Stem Cell 上发表论文，专注于神经疾病，脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究，已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。主题：脑卒中研究中的血流监测技术激光多普勒激光散斑超声多普勒核磁共振成像双光子显微镜讲师：殷维君瑞沃德微循环监测解决方案专家，在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验，主导动物活体成像解决方案的设计及优化，专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。上期直播间互动问题这次我们全部为小伙伴解答Q1：组织剪切的大小有没有具体要求，肿瘤组织一般2-4mm可以吗？A1：这要根据组织类型去判断，一般会预处理成10mm左右的组织块，太大可能会导致处理不完全，太小可能导致细胞死亡增加，甚至导致样本变稠等。Q2：细胞活率80%就可以了吗，看到一些资料写的都要90%以上。A2：这个需要根据下游实验的需求灵活调整，如果样本存活率不能达到要求的话，除了优化实验条件以外，还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。Q3：低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么？区别是什么？A3：37℃条件下进行组织解离，由于细胞转录活跃，因此解离过程中基因表达可能会发生改变，可能会干扰应激反应相关基因表达，所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核，同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式，但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。另外，温度对不同细胞种类也有一定影响，比如在进行脑组织解离时，热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取，但是会大量富集小胶质细胞，所以在进行组织解离时，根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。Q4：裂红处理有什么注意事项吗？A4：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。Q5：流式染色时间及温度如何选择？A5：染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力，染色时间和温度，受限于抗体浓度，一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验：当不清楚说明书的情况，我会选择室温染色12-15min（取决于抗体浓度微调），或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损，否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理，特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性，应尽快染色。Q6：请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照？A6：关于对照设置，这个比较复杂，一般我们是选择同型对照作为阴性对照组，得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同，且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 还有一类就是最常见的纯阴性对照，检测细胞群不进行任何抗体处理，直接进行流式检测，这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响，这种方法的好处是节约抗体，毕竟抗体很贵。Q7：如何减少补偿的干扰？A7：补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况，此时，可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好，也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料，这样补偿干扰会尽量消除。因此，往往需要查看染料的波长范围，此外，对于4色以上的多色标记情况，一般不常见，此时往往染料的波长范围难以避免的重叠，这时候，推荐使用抗体公司推荐的配色方案，尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正，可以适当修正这个影响。Q8：细胞自发荧光如何解决？A8：细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光，植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光，然后一些药物处理下，药物本身带有发色基团，也可能自荧光，此时，纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况，染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠，这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候，考虑到药物的情况，就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照，往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好。如果您错过前四期直播课或想再回顾一遍戳这里→即可查看前四期直播回放↓↓本期直播记得预约噢，全程免费还可进群轻松获取后续科研直播课信息以及更多丰富学术干货~
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