文献速递 | 祝贺武汉轻工大学雷磊团队在Applied Microbiology and Biotechnology发表漆酶理性设计新策略

Enhancing catalytic efficiency of Bacillus subtilis laccase BsCotA through active site pocket design
论文链接：

https://doi.org/10.1007/s00253-024-13291-3

背景介绍：
漆酶是一类含铜氧化酶，能够氧化多种酚类化合物，在染料脱色、废水处理等绿色工业过程中具有重要应用前景。枯草芽孢杆菌漆酶BsCotA因其优异的热稳定性而备受关注，但其对常用介体ABTS的催化效率仍有待提升。传统的定向进化方法筛选工作量大，且常面临“效率-稳定性”难以兼得的权衡难题。

武汉轻工大学雷磊团队 创新性地提出了 “活性口袋多靶点计算设计+虚拟筛选” 的高效策略。研究首先基于BsCotA晶体结构，利用FuncLib算法对底物ABTS周围4?范围内的8个关键残基进行多样性设计，生成了50个包含3-5个位点突变的计算变体。随后，通过Rosetta分子对接进行虚拟筛选，仅从50个变体中锁定5个候选进行实验验证，极大地减少了实验工作量。

研究方法与仪器：
在成功获得计算预测的候选变体基因后，研究的关键在于制备高纯度、有活性的重组蛋白以进行准确的酶学表征。该研究中，所有野生型及突变体漆酶的表达与纯化均使用了上海金鹏分析仪器有限公司的JP-blupadStar蛋白纯化系统。 该系统高效完成了镍柱亲和层析（IMAC）与后续的缓冲液置换透析，为所有变体蛋白的高纯度、高活性样品制备提供了可靠保障，确保了后续酶活、动力学参数及热稳定性测定的数据准确性与可比性。

成果总结：
实验结果显示，5个测试变体均保持功能，其中4个变体的催化转换数（kcat）显著提升。最优变体 F-09 (A227F/G321S/L386Y/G417H) 对ABTS的催化效率（kcat/KM）达到1.18 × 10 M1s1，较野生型提升了7.7倍，同时其热稳定性（T50）还提高了5°C，成功打破了“效率-稳定性”的权衡。机理分析表明，关键残基Leu386突变为芳香族氨基酸（酪氨酸）优化了底物结合口袋的几何形状，是效率提升的主因。在靛蓝胭脂红染料脱色应用中，F-09变体在相同条件下的脱色效率达到野生型的3.6倍，展现了优异的工业应用潜力。