Sepax C-Pro SpinOculation程序：助力在封闭系统中高效进行慢病毒载体自动化转导

利用病毒载体转导基因，在现今的细胞治疗产品生产中起到至关重要的作用。目前获批上市的所有自体细胞治疗方法，均采用慢病毒或者逆转录病毒转导CAR基因导入来自病人自身的淋巴细胞，使其获得杀灭肿瘤的能力。

另一备受关注的领域——TCR-T细胞治疗，同样是通过这两种病毒载体向淋巴细胞内转入高亲和力T细胞受体，使其获得相应的功能。

临床实践中，高转导率的基因修饰淋巴细胞或者CD34+细胞表现相对高的治疗有效性。转导效率低往往会带来各种问题，比如更多的起始材料，包括自体病人的外周血淋巴细胞和GMP级别的病毒载体；或者更长时间的培养扩增以达到足够的有效细胞数量。这些都显著提高了细胞治疗产品的生产成本。

与静置转导相比，通过离心的方式可以显著增强慢病毒或者逆转录病毒介导的基因转导效率。在离心转导过程中，病毒载体和细胞通过离心而共沉降，达到帮助病毒载体附着在细胞表面的目的。这也是临床前研究实验室经常使用的方法。然而实验室阶段多采用开放式操作，包括用6孔板或者细胞袋在开放式离心机中操作，进而带来很多安全性的风险。因此采用密闭管路自动化进行操作，是临床产品生产的发展方向。

美国国立卫生研究院（NIH）下辖的转化医学研究院（Department of Transfusion Medicine）采用Sepax C-Pro作为密闭自动化细胞处理平台，进行离心转导和传统静置转导和手工离心转导的方法对比。证实采用C-Pro系统进行离心转导，和传统手工细胞转导的效率相当，都优于静置转导的方法。

健康供体活病人的外周血PBMC经过磁珠分选后，CD4+和CD8+的细胞被筛选出来作为初始细胞。利用三种不同的慢病毒载体测试转染效率。载体分别为CD19/22双特异性CAR（MOI 10）、FGFR4 CAR（MOI 10）和CD22 CAR（MOI 2）。

CD4/CD8细胞在Day0解冻后，以2×10⁶/mL密度接种与AIM-V培养基中，然后用磁珠激活。

Day2，细胞分别使用细胞袋离心转导或Sepax C-Pro离心转导。同时静置转导和静置培养（不添加病毒载体）作为对照组。转导后，细胞移至恒温培养箱中静置培养。

培养基更换和去磁珠分别于Day3和Day4完成。随后细胞被稀释至0.4×10⁶/mL培养至Day7，然后稀释至0.6×10⁶/mL培养至Day9收获。收获的细胞用CS10冻存液冻存用于后续的功能性研究分析。为了更好的优化C-Pro离心转导条件，转导时长0.5 h和1 h的实验也同时进行了测试。

经过CD19/22慢病毒转导后，健康人供体细胞扩增后的转导阳性率分别在day7和day9测定。结果显示，扩增天数没有显著影响转导效率，但是通过离心的方式，阳性率从静置转导的30%左右显著提升至70+%。细胞扩增倍数通过细胞计数计算。离心转导后细胞扩增数量较静置转导略有提升。单个细胞载体拷贝数是考量转导安全的一个重要参数。

根据FDA规定，平均在拷贝数应该小于5个。手动离心转导和Sepax C-Pro都满足相应要求。而无论静置转导或离心转导，对细胞生长的活性没有任何影响。而对比应用C-Pro不同离心时长的转导结果，我们认为1 h的转导效率最优。因此后续实验均以1 h进行。

接下来，携带其他CAR的病毒载体，包括FGFR4和CD22，也使用同样的条件，在Sepax C-Pro上进行了测试，以确认我们观察到的结果和CAR的结构是否有相关性。

健康供体的细胞以同样的条件经过静置转导，手动离心转导和C-Pro自动转导后，相关数值没有显著性差异（图3）。离心转导的效率显著高于静置转导，同时对细胞活性、扩增倍数、单细胞病毒载体拷贝数和CD4/CD8细胞比值没有影响。

肿瘤细胞杀伤能力和分泌IFN-γ能力是判定CAR-T细胞体内有效性的重要表征。NALM6肿瘤细胞系可以稳定表达CD19和CD22。

我们通过对比静置转导CD19/22双靶点的CAR-T细胞或CD22单靶点的CAR-T细胞，与对应离心转导得到的CAR-T细胞，与NALM6细胞共培养的杀伤能力（图4），和在杀伤过程中分泌的IFN-γ浓度（图5），来分析其细胞功能性表征。

Remley V.A., et al. High efficiency closed-system gene transfer using automated spinoculation. J Transl Med. 2021 Nov 24;19(1):474.