自2017年全球首款获得美国FDA批准的CAR-T药物上市以来，截至2025年7月全球已经有14款CAR-T药物获批上市。2024年以前获得FDA批准的6款CAR-T产品在2024年全球录得超过45亿美元的销售额，其中传奇生物与强生合作的CARVYKTI全年销售额达9.63亿美元，同比增长超过90%，2025年上半年销售额8.08亿美元，较2024年同期取得翻倍增长。
CAR-T疗法全球热销的背后是慢病毒载体作为遗传信息传递载体在所有FDA批准上市CAR-T疗法中的良好应用。
体内CAR-T开启慢病毒载体应用第二曲线。随着阿斯利康、赛诺菲以及诺华等MNC逐渐加码体内CAR-T领域的投资，体内CAR-T因其“即用型”的特点逐渐成为行业焦点。相较于传统体外CAR-T繁琐的制备工艺，体内CAR-T直接通过病毒或非病毒载体在体内完成T细胞的基因改造，显著降低生产成本、缩短生产周期。而相较于非病毒载体，慢病毒载体在实体瘤领域因其改造后的T细胞存留时间更长而被广泛期待。
慢病毒载体，为细胞治疗而生。传统的体外CAR-T中慢病毒载体作为重要的递送载体应用于所有FDA批准上市的CAR-T疗法中，新兴的体内CAR-T领域，慢病毒载体凭借其可实现单次给药、靶向改造、免疫原性低尤其是临床经验丰富，已经被多个体内CAR-T项目采用。2025年7月22日，国际知名杂志《柳叶刀》发布了同济医院团队的研究成果：使用慢病毒载体直接感染患者体内T细胞，原位编辑为CAR-T细胞并实现了4例复发/难治性患者100%客观缓解（2例严格完全缓解）。
降低慢病毒载体生产成本，提升创新疗法可及性。在传统体外CAR-T疗法中，慢病毒载体生产成本（包含质粒生产）约占据CAR-T生产成本的20%，是CAR-T疗法高昂定价的重要推手；在体内CAR-T疗法中，慢病毒载体更是核心生产物料，对品控、批间一致性以及成本控制都提出了更高的挑战。
Cytiva联合国内创新公司深研生物共同开发了EuLV系统——慢病毒载体稳转细胞株（SPCL）以及包装细胞株（PCL），以降低慢病毒载体生产成本，提升创新疗法可及性。该系统使用可诱导生产细胞系，通过高细胞密度悬浮培养，在化学成分限定培养基（CDM）中生产慢病毒载体。使用慢病毒载体稳转细胞株制备的高质量慢病毒载体，可满足传统CAR-T和体内CAR-T疗法对病毒载体的需求。
稳转细胞系的构建是首先将目的基因插入包装细胞株中以得到稳定的生产细胞富集群（EP群），从中筛选出最优的单克隆生产细胞株之后，其病毒滴度相较于最初的贴壁四质粒瞬转工艺提升了10-50倍（图1）。
图1：不同客户项目SPCL慢病毒载体滴度
在后续的放大验证实验中，SPCL依旧展现优异的滴度水平。
在Cytiva中国科创中心，Fast Trak的上游科学家基于化学成分确定的基础培养基和补料培养基，分别在WAVE生物反应器和XDR10生物反应器上验证了SPCL良好的可放大性。
以CDM为基础培养基，将SPCL复苏于125 mL摇瓶中，培养体积30 mL。培养条件为37℃，170 rpm（振幅2.6 cm），CO2浓度为8%。细胞接种密度为4 E+05 cells/mL，每3天传代一次，于P3代接种至WAVE以及XDR10生物反应器中。在WAVE生物反应器中继续培养4-5天，当细胞密度达到1 E+07 cells/mL时，添加诱导剂和补料开始产生慢病毒载体。在加入诱导剂后第二天再次加入相同体积的补料，并继续培养24小时后进行收获（图2）。
图2：SPCL于WAVE以及XDR10生物反应器中的放大验证流程
SPCL在WAVE以及XDR10生物反应器中的生长曲线如图3所示。接种至XDR生物反应器4天后细胞密度达到13 E+06 cells/mL，WAVE生物反应器中于5天后达到10 E+06 cells/mL后开始进行第一次补料与诱导剂的添加，此时二者的细胞活率均高于98%。诱导48小时后，两个生物反应器中的细胞活率均在80%左右，活细胞密度在7 E+06 cells/mL左右。使用荧光显微镜检测了收获时的荧光强度，通过荧光与白光的对比展现了100%的病毒表达率，远高于瞬转约50%的转染效率（图4）。离心后的上清液为病毒收获液。
图3：SPCL在WAVE以及XDR10生物反应器中的生长曲线
图4：WAVE以及XDR10收获时细胞荧光检测
使用HEK293T细胞进行转导滴度的检测，并使用EuLV LVV作为阳性对照。经检测之后的病毒转导滴度见图5。基于WAVE生物反应器放大的病毒转导滴度可达1.7 E+08 TU/mL，进一步放大至XDR10中的病毒转导滴度亦达到了1.1 E+08 TU/mL，展现了基于稳转株工艺的SPCL具备的强大的可放大性。
图5：WAVE以及XDR10病毒滴度
使用EuLV系统的SPCL在提升病毒滴度的同时降低工作量，简化生产流程50%，生产成本降低80%，相较于传统贴壁培养病毒产量可提升10-50倍。
将慢病毒载体包装所需的Rev、Gag/Pol以及VSV-G基因以及分子开关稳定插入到HEK293T细胞的基因组中，经单克隆细胞筛选获得EuLV包装细胞系。该系统采用单个GOI质粒瞬转的方式进行LVV包装，适用于快速推进管线进程。在Cytiva中国科创中心，Fast Trak科学家们与深研生物一起对PCL的LVV包装性能进行了测试。
将PCL复苏于摇瓶中，每三天传代一次，适应两代以后进行慢病毒载体瞬转包装。细胞以4 E+05 cells/mL的密度接种于摇瓶，细胞密度达到4.5-5.5 E+06 cells/mL且细胞活率大于90%时，进行GOI单质粒瞬转。根据细胞培养体积制备质粒转染试剂复合物，PEI MAX的用量为5-6 μg/mL，GOI质粒的用量为2 μg/mL。将质粒转染试剂复合物缓慢加入到细胞培养摇瓶，将转染后的细胞放入37℃，8% CO2的二氧化碳振荡培养箱中培养5~6小时。随后将摇瓶转移至生物安全柜中，加入8%培养体积的EuLV Inducer 04，放入37℃，8%CO2的二氧化碳振荡培养箱中继续培养42小时。
培养结束后使用Vi-CELL进行细胞活率以及活细胞数量的检测。以1500 X g离心10分钟，收集离心上清液，慢病毒载体感染滴度检测使用流式法（FACS）。
图6：PCL以及传统瞬转工艺对比
检测结果显示（图6），使用基于PCL的单质粒瞬转工艺，慢病毒载体感染滴度可以达到2.1 E+08 TU/mL。相较于目前四质粒瞬转工艺平均感染滴度的2 E+07 TU/mL，使用基于PCL的瞬转工艺在感染滴度上提升了10倍以上。
慢病毒载体稳转细胞系降低病毒生产成本，显著提升新型疗法可及性。慢病毒载体作为已经经过临床验证的遗传信息递送载体，被广泛应用于包括细胞治疗、基因治疗等新型疗法中。然而当前使用四质粒瞬转工艺进行慢病毒载体生产，不仅增加了潜在批间差异性，更使得成本居高不下。Cytiva联合合作伙伴在中国推出慢病毒载体稳转细胞系，以20%成本造就10倍转导滴度，助力提升新型疗法可及性。
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