慢病毒载体（Lentivirus Vectors, LVV）是一类由类逆转录病毒（Lentivirus）衍生的病毒载体，广泛应用于基因治疗领域。逆转录病毒（Retroviruses）是一类能够将其基因组整合到宿主细胞DNA中的病毒，这种特性使得它们非常适合作为基因传递工具。在这些逆转录病毒中，人类免疫缺陷病毒（HIV）及其衍生病毒最为知名，后者被用作为制作LVV的基础。与常规逆转录病毒不同，Lentivirus具有能感染静止细胞的能力，因此能高效地将外源基因传递给细胞，从而在基因治疗中发挥重要作用。
LVV主要通过重组技术从HIV等病毒中提取并修改其基因组，以去除病毒的致病部分并引入目标基因，使其能够安全、有效地传递遗传物质。这些载体已被用于多种临床试验中，尤其是对于遗传性疾病的治疗和癌症免疫疗法的研究。与其他病毒载体（如腺病毒或腺相关病毒）相比，LVV具有以下优势：
长期表达
LVV能够将基因整合到宿主细胞的基因组中，提供长期的基因表达。
高效传导
由于其能够感染多种类型的细胞，尤其是非分裂期的细胞，LVV在基因转导方面具有较高的效率。
广泛适用性
LVV适用于多种哺乳动物细胞，包括人类细胞，是许多基因治疗策略中最常见的载体之一。
LVV载体结构
然而，LVV的生产过程中仍面临许多挑战，尤其是在病毒颗粒的纯化和表征方面。生产LVV时，通常需要高效的病毒颗粒分离和纯化技术，因为这些病毒载体往往和其它杂质（如病毒宿主细胞杂质、未包装的病毒蛋白、外源基因产品等）混杂在一起，这些杂质可能影响最终的产品质量，甚至产生不良反应。鉴于LVV对病毒颗粒的质量和纯度要求较高，开发可靠的分析技术来表征这些颗粒变得至关重要。
作者评估了几种颗粒表征技术在分析两种不同生产工艺下制造的LVV产品中的应用。具体而言，研究关注的是来自悬浮培养工艺（材料1）和贴壁培养工艺（材料2）的LVV样品。研究的目标是评估动态光散射（DLS）、成像光学显微镜（ILM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、微流脉冲纳米分析技术（MRPS）和沉降速度分析超速离心（SV-AUC）等五种分析技术在粒径分布、纯度以及颗粒杂质存在的表征中的有效性。
材料1的p24 ELISA滴度是材料2的三倍，表明材料1每毫升包含的病毒颗粒更多。然而，材料1的浑浊度较高，说明其中含有较多的大颗粒杂质。相对而言，材料2的浑浊度较低，杂质较少。两种样品在分析前都需要进行稀释，其中材料1的稀释倍数较大，因为其浑浊度较高。
材料1和2
分析技术的比较评估
DLS：动态光散射（DLS）作为一种广泛应用的颗粒大小分析技术，在LVV样品的表征中面临困难，尤其是样品的多分散性和颗粒杂质影响了数据的可靠性。该方法生成了宽泛的、未分辨的粒径分布峰，无法准确测量LVV颗粒的大小，特别是在颗粒杂质较多时。因此，DLS并不适合分析这些复杂样品。
ILM和NTA：在成像光学显微镜（ILM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）中，材料1的粒径分布表明存在较多的大颗粒杂质，尤其是在未过滤的样品中。虽然过滤去除了部分大颗粒，但小颗粒杂质仍然影响结果。ILM分析显示，材料1过滤后，颗粒浓度减少了约50%，粒径分布有所变化，这表明通过过滤去除了较大的颗粒。然而，由于仪器的低敏感性，ILM在较小颗粒的检测上存在局限，容易出现误解。NTA提供了比ILM更可靠的数据，但仍然难以区分LVV颗粒和杂质，尤其是在复杂、宽分布的材料1样品中，LVV颗粒与杂质难以区分。
MRPS: 微流脉冲纳米分析技术（MRPS）在过滤后的样品中表现良好，能够更准确地测量材料2的颗粒大小分布。然而，未过滤的材料1在MRPS分析中导致了卡管现象，使得该技术在未过滤的材料1样品中不适用。虽然MRPS能够成功表征材料2中的LVV颗粒，但在材料1中，小颗粒杂质与LVV颗粒重叠，需要通过手动数据处理才能分辨出LVV的峰值。
SV-AUC：沉降速度分析超速离心 (SV-AUC) 是一种有前景的LVV表征技术, 在所有测试的技术中， SV-AUC表现出了最好的结果，特别是对于含杂质较少的材料2。SV-AUC能够通过沉降系数分离不同粒径的颗粒，这对于分析具有不同粒径的颗粒混合物非常有优势。通过对样品施加离心力，SV-AUC能够根据颗粒沉降速度提供清晰的颗粒分布图谱。作者研究发现，SV-AUC通过在7,000 rpm下进行离心，成功检测到了材料2中的LVV颗粒，并揭示了一个沉降系数约为650 S的峰值，这与文献中报道的逆转录病毒的沉降系数（600 S）相符。这一发现表明，SV-AUC在LVV颗粒的表征中具有很高的特异性。
SV-AUC的两步离心方法进一步提高了分辨率。在第一步中，使用7,000 rpm的中速离心来分离LVV颗粒和大颗粒杂质。在第二步中，采用更高的离心速度（42,000 rpm）来更好地分离较小的杂质，包括人白蛋白等蛋白质。这种双重离心方法使得研究能够在同一实验中分离出LVV颗粒和更小的杂质颗粒。从SV-AUC获得的沉降系数分布显示，材料2中在650 S左右有一个清晰的峰值，并且A260/A280的比值为1.3，这表明该峰值很可能对应于LVV颗粒，符合LVV颗粒通常由核酸和蛋白质组成的特点。这一结果验证了SV-AUC作为一种可靠的LVV颗粒表征方法的有效性，尤其在纯净的样品中具有良好的适应性。
AUC分析结果
总结和展望
尽管SV-AUC在材料2中表现出了良好的分辨能力，但在材料1中，由于存在大量大颗粒杂质，导致LVV颗粒被淹没，因此难以准确分辨出LVV颗粒。SV-AUC作为一种强有力的粒径分布表征技术，在分析LVV颗粒时具有显著优势，尤其适用于杂质较少的样品。SV-AUC能够基于沉降系数分离病毒颗粒，结合双步离心方法，可以准确检测LVV颗粒并与杂质区分开来。尽管在更复杂的样品中，SV-AUC的应用仍然面临挑战，但它为LVV产品的质量控制提供了一个有前景的解决方案。未来，改进样品制备技术，如选择性去除杂质或富集LVV颗粒，可能会进一步提高SV-AUC在日常应用中的适用性。
参考文献：
https://www.wikiwand.com/en/articles/Lentiviral_vector_in_gene_therapy
Stadler D, Helbig C, Wuchner K, Frank J, Richter K, Hawe A, Menzen T. Challenges in the analysis of pharmaceutical lentiviral vector products by orthogonal and complementary physical (nano)particle characterization techniques. Eur J Pharm Biopharm. 2024 Jul;200:114340. doi: 10.1016/j.ejpb.2024.114340. Epub 2024 May 24. PMID: 38797222.
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