显微应用 | 癌症免疫学中的3D超多标成像（下）

在成像时保持染料的光谱重叠尽可能低至关重要，但在如此高密度的多标记样本中，串色无法完全避免。

在这种超多标水平上，拆分工具提供了一种识别和量化每个标记物贡献的方法。

传统方法中，单独染色一个样本（每个标记物一个）作为拆分的对照和起点。对照样本中获取的信息用于构建拆分矩阵。单染色方法比较繁琐，因为这需要大量的样本和精力，来创建与多重标记数量相同数量的样本。

计算出拆分矩阵后，使用相应的设置对完整的15标样本进行采集。拆分后的数据会自动生成（图 3），并附上对应的原始图像，方便后续分析和解释。带有所有生物相关通道的样本片段展示了单轮染色方法的丰富信息（图3a）。

癌症样本的详细视图展示了不同的微环境。例如，富含淋巴细胞的区域（B 和T细胞）展示了免疫系统在肿瘤中已经开始执行功能（图3b）。这些淋巴细胞大多具备免疫功能，直接或间接抵抗肿瘤生长（图3c中TCF1和PD1的表达），其中部分细胞还具有调节作用（图3c中FoxP3的 表达）。髓系细胞在肿瘤中通常更为常见，功能各异，可发挥抗肿瘤或促肿瘤作用，其空间分布在很小尺度上呈现显著差异（图3d）。

样本中的癌症、基质和细胞外基质标记物表现出较高的异质性。虽然这些标记物的分布较为复杂（例如，成纤维细胞的细胞过程），但它们也明显覆盖了大片上皮和内皮细胞区域（图3e–g）。高级拆分程序确保在组织内准确识别不同的细胞类型及其功能状态（例如，免疫细胞亚型、组织决定因子和疾病决定因子）。

总体而言，建立一种稳健、快速且灵活的3D成像方法以评估癌症组织对于解析肿瘤微环境的变化至关重要。该成像工作流程的高效性可以加速结果评估、决策制定，并为后续实验设计提供有力支持。

一次性成像方法为此工作流程带来了两项关键优势。首先，能够对与癌症标记物相关的感兴趣区域（ROIs）进行深入探索，例如在不同放大倍数和更高分辨率下进行更详细的空间特征分析。其次，所有标记物在三维环境中同时存在，确保在组织中发现的相互作用置于其预期或意料之外的组织微环境中进行分析。

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