黄金钓手Biacore｜小功能，大应用

2024-09-20 18:13:55 56阅读次数

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Biacore上市三十余年，因其灵敏度高、功能全面、自动化水平高等特性，助力了超过6.5万篇科学论文的发表，应用领域百花齐放。“百花”中，除了经典的动力学/亲和力测定外，药物筛选、竞争性结合、效价测定、构效关系、组装顺序、未知因子发现等相关科研成果也是“花团锦簇”，这些与Biacore实时、无标记、高灵敏、高通量等特点息息相关。今天我们就一起来关注Biacore的样品回收-“垂钓”功能携手传统中医药等研究共同“绽放”的相关成果。

SPR-MS-SPR：荷叶中TNF-α抑制剂的发现与鉴定

二黄祛脂颗粒由升降散化裁而成，具有降脂抗炎的功效，临床中被用于非酒精性脂肪肝炎的治疗。为了明确二黄祛脂颗粒中抗炎的活性分子，石河子大学新疆植物药资源利用教育部重点实验室的研究团队选择肿瘤坏死因子α (TNF-α) 为靶点，利用Biacore制备TNF-α芯片，“垂钓”中草药提取物中的活性分子，并用LC-MS进行鉴定得到3种活性分子。随后作者继续用Biacore测定了三种活性分子与靶点TNF-α的亲和力，明确其结合能力，最终在细胞水平证明其TNF-α抑制剂的作用。相关成果于2023年发表在Analytical and Bioanalytical Chemistry^[1]。

图1：荷叶中TNF-α抑制剂的发现与鉴定研究思路

双靶点药物发现策略

中药作用机制广泛存在多组分、多靶点的作用特征，基于此，第二军医大学的研究团队，利用Biacore开发了一种双靶点药物开发方法，相关成果近期发表在Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis^[2]。文章选取S蛋白RBD和ACE2，将其分别偶联在芯片的不同通道上，用两种配体蛋白，同时“垂钓”中草药提取物中的活性分子，与其中一种或同时与两种配体有结合的分子，并进行质谱鉴定。随后作者再次用Biacore检测了两个靶点与鉴定得到的活性分子的亲和力，最终发现葛根中的葛根素对S蛋白RBD和ACE2均具有特异性结合亲和力。

图2：双靶点“配体垂钓”药物发现流程

除了双靶点“配体垂钓”，6通道的Biacore设备将赋予多靶点药物发现更多可能！

膜蛋白靶点药物发现

膜蛋白在很多生理过程中发挥重要作用，约一半的小分子药物以膜蛋白为靶点。在膜蛋白靶点的药物发现中，膜蛋白制备困难，体外纯化的膜蛋白颗粒与化合物分子量差异巨大，因此实验方案受限。为了应对这些难题，第二军医大学的研究团队首先制备了膜蛋白-慢病毒颗粒CXCR4-LVPs，选择Biacore，将LVPs偶联在CM5芯片上，通过阳参药物AMD3100验证了方法的可靠性。作者随后继续使用Biacore对中草药提取物进行膜蛋白“配体垂钓”，从川芎提取液中获得了Senkyunolide I，并且用Biacore测定其与CXCR4的亲和常数为2.94±0.36 μM。综上，作者成功构建了一种基于Biacore的膜蛋白靶向活性成分发现策略，此方法将成为从作用于膜蛋白的复杂系统中筛选目标成分的有效工具^[3]。

图3：Biacore-膜蛋白“配体垂钓”方法路线

α-酮戊二酸降糖新靶点发现

除了通过配体“垂钓”活性分子，用药物反向“垂钓”靶点当然也可以通过Biacore完成。为了研究α-酮戊二酸 (AKG) 降糖的新机制，华南农业大学的研究团队首先将AKG修饰生物素，利用Biacore将其偶联在SA芯片上，然后用AKG“垂钓”肝脏提取总蛋白样品中可能结合的靶蛋白，最终鉴定得到P2RX4^[4]。

图4：利用Biacore SA-AKG芯片“垂钓”靶蛋白

肿瘤迁移、侵袭机制发现

Mas受体通过Ang- (1-7) 依赖的AKT信号传导促进透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 细胞的迁移和侵袭，而其机制并不明确。首都医科大学的研究团队，利用Biacore将Mas-CT蛋白偶联在芯片上，从细胞裂解液中“垂钓”与其结合的蛋白，并利用质谱鉴定得到8种含PDZ结构域的蛋白。后续发现NHERF4是多个独立ccRCC数据集中唯一下调的基因，确定了NHERF4是ccRCC侵袭性的一种新的调节因子^[5]。

图5：利用Biacore从细胞裂解液中“垂钓”与Mas-CT结合的蛋白

果实成熟机制

果实成熟是一个受转录因子、激素和其他调节因子共同作用的复杂过程，在调控果实成熟的转录因子网络中，MADS-box转录因子是一个重要的调节因子。SlFERL作为MADS-box转录因子可能的靶基因，在果实成熟过程中具有潜在的作用。通过蛋白Biacore的“垂钓”实验，研究人员在果实提取物中找到了与SlFERL结合的S-腺苷蛋氨酸合成酶1 (SISAMS1)^[6]。

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“垂钓”，即利用Biacore将粗样品中与芯片表面配体有结合的分子洗脱回收，然后用质谱等方法鉴定回收的样品，继而用Biacore检测二者精准的动力学/亲和力测定，串起了SPR-MS-SPR的研究路线。据小编不完全统计，目前使用此功能发表的文章近百篇，其中中国学者发表数量接近一半！研究领域涵盖了中医药研究、药物开发、分子机制、蛋白组学、植物学、诊断方法开发等等。相信此功能未来将会支撑更多的成果发表，Biacore也将不遗余力支持中国学者的科研创新和进步！

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参考文献

[1]. Guan JW, Xu Y, Yu W, et al. Biosensor-based active ingredient recognition system for screening TNF-α inhibitors from lotus leaves. Anal Bioanal Chem. 2023;415(9):1641-1655. doi:10.1007/s00216-023-04565-2

[2]. Zhang Y, Wang D, Wang X, et al. A dual-target SPR screening system for simultaneous ligand discovery of SARS-CoV-2 spike protein and its receptor ACE2 from Chinese herbs. J Pharm Biomed Anal. 2024;245:116142. doi:10.1016/j.jpba.2024.116142

[3]. Chen L, Lv D, Wang S, et al. Surface Plasmon Resonance-Based Membrane Protein-Targeted Active Ingredients Recognition Strategy: Construction and Implementation in Ligand Screening from Herbal Medicines. Anal Chem. 2020;92(5):3972-3980. doi:10.1021/acs.analchem.9b05479

[4]. Yuan Y, Zhu C, Wang Y, et al. α-Ketoglutaric acid ameliorates hyperglycemia in diabetes by inhibiting hepatic gluconeogenesis via serpina1e signaling. Sci Adv. 2022;8(18):eabn2879. doi:10.1126/sciadv.abn2879

[5]. Yang Y, Liang J, Zhao C, et al. NHERF4 hijacks Mas-mediated PLC/AKT signaling to suppress the invasive potential of clear cell renal cell carcinoma cells. Cancer Lett. 2021;519:130-140. doi:10.1016/j.canlet.2021.06.021

[6]. Ji D, Cui X, Qin G, Chen T, Tian S. SlFERL Interacts with S-Adenosylmethionine Synthetase to Regulate Fruit Ripening. Plant Physiol. 2020;184(4):2168-2181. doi:10.1104/pp.20.01203

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