【臭猪肉事件】肉品腐败异味？可视化的风味分析给您直观答案

“整盆肉都是臭的！”近日，云南昆明有家长发视频称，官渡区云子中学长丰学校学生食堂的生肉有臭味，该事件引发广泛关注。官渡区联合调查组通报确认，该批次鲜猪肉片系因运输及存储不当导致变质变臭。

肉品腐败变质通常表现为异味、发黏、变色和变软等，其中由微生物产生的挥发性化合物是肉品腐败异味的主要来源。挥发性盐基氮、菌落总数等是反映肉品腐败的重要指标。

探究肉品腐败进程中挥发性风味物质的变化规律，可通过气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术分析其挥发性风味物质，揭示肉品腐败过程中不良风味的变化规律，为肉品腐败进程的监测提供一定的理论依据。

新鲜牛上脑肉，屠宰后2 h内低温运送至实验室。

气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)联用仪

试样制备方法

选用12月龄西门塔尔牛后颈部位牛上脑瘦肉作为实验材料，将牛肉切分为约400g/块的肉块，进行托盘包装，将肉样置于普通塑料托盘，用透明高阻隔塑料袋包裹。后于4 ℃分别保存 0、3、7 和10天，分别命名为D0、D3、D7 和D10。

GC-IMS 检测

将牛肉粉碎后真空保存于铝箔袋中，-40 ℃保存备用。精确称取3 g样品于20 mL顶空进样瓶中，密封，自动进样器参数设置为：顶空瓶孵化温度 60 ℃，孵化时间15 min，孵化速度500 r/min，进样针温度85℃，进样体积500 μL，每个样品设3个重复。

1、牛肉腐败进程中挥发性成分谱图分析

图1  牛肉腐败进程 GC-IMS 二维谱图（A）和二维差异谱图（B）

通过GC-IMS技术测定了牛肉腐败进程的挥发性风味成分，挥发性风味谱图如图1A所示，横坐标为化合物的离子迁移时间，纵坐标为挥发性化合物的保留时间，横坐标1.0 处的红色竖线为归一化后的反应离子峰（RIP 峰）。图中每个点代表一种化合物，红色代表该物质的含量较高，蓝色代表该物质的含量较低。

图中各点间分离明显，无交叉重合，说明 GC-IMS 能较好地分离牛肉腐败进程的挥发性风味成分。随着时间的延长，谱图中的亮点数目和大小不断增加，说明在腐败过程中牛肉的挥发性风味成分种类和含量逐渐增加，为更直观地分析腐败过程中牛肉风味的变化情况，以D0-1为对照，各组样品扣除对照，若挥发性风味成分含量相近则扣除背景后为白色，若挥发性风味成分含量高于或低于对照，则扣除背景后为红色或蓝色，如图1B所示。各组样品挥发性风味组成存在显著差异，随着时间的延长，图中红色区域面积不断增加，说明腐败过程中，风味物质含量显著增加。

2、挥发性化合物指纹图谱分析

图2  牛肉腐败进程中挥发性风味物质指纹图谱

绘制牛肉腐败进程的挥发性风味物质指纹图谱，如图2所示。通过指纹图谱，可以直观地对比4组牛肉在风味物质组成和含量上的共性和差异。图中同一行为一个样品检出的挥发性成分组成情况，同一列为同一挥发性风味成分在不同样品中的信号峰情况，信号峰颜色的明亮程度代表了对应风味化合物含量的高低。

图中A区域是4种共有且差异相对较小的挥发性风味成分，主要包括 3-羟基-2 丁酮、丁醛、2-甲基四氢呋喃-3-酮和乙酸等；B 区域是D0和D3样品中含量较低，D7和D10样品中含量较高的挥发性化合物，主要包括异丁醇-D、异丁醛、乙酸乙酯-M 和甲苯等；C区域为 D10样品含量相对较高的挥发性化合物，主要包括2-甲基-3-甲硫基呋喃、乙二醇二甲醚、丁醛-M 和正丙醇-D等。

3、挥发性化合物定性及定量分析

采用保留时间和离子迁移时间对挥发性化合物进行定性分析，利用IMS系统峰体积进行定量分析，结果如表 2 所示。

表 2 牛肉腐败进程中挥发性风味物质

利用 GC-IMS 技术检出55种挥发性风味化合物，其中12种挥发性化合物存在单倍体和二聚体（正己醇、异戊醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、异丁醇、丙烯酸丁酯、乙酸乙酯、丁醛、正己醛、四氢吡咯和 2,2,4,6,6-五甲基庚烷）。酮类物质 12种、醇类物质10种、酯类物质9种、醛类物质8种、烃类物质4种、呋喃化合物3种、含硫化合物和胺类物质各2种、吡咯、醚类、噻唑、酸类和吡嗪类物质各1种。如图3所示，各类风味物质在腐败过程中均有显著增加。

图3  牛肉腐败进程中挥发性化合物峰体积

4、多元统计分析

主成分分析

图4  牛肉腐败进程中牛肉挥发性风味主成分分析得分散点图

为进一步明确牛肉腐败进程中挥发性风味成分的差异，以挥发性风味物质峰体积为数据源，进行 PCA 分析。结果如图4所示，4个样本的 12 个样本点分别位于坐标系的不同位置，各组间分离明显，无交叉重合，说明牛肉腐败进程的风味差异显著，与指纹图谱分析结果相互印证。在主成分1上D0和D3分布较为接近，D7和D10分布较为接近，表明D0和D3风味较为接近，D7和D10 风味较接近，与聚类分析结果一致。

PLS-DA 分析

图5  牛肉腐败进程中 PLS-DA 得分散点图（A）及置换检验结果（B）

为进一步分析牛肉腐败进程的挥发性风味差异，通过PLS-DA 对牛肉腐败进程的风味进行分析，结果如图5A所示，4个样本的12个样本点均位于95%的置信区间内，组间分离明显，无交叉重合，说明牛肉腐败进程的风味差异显著，所建立的 PLS-DA 模型能较好地区分4种进程。

为了进一步验证模型是否出现过拟合现象，采用 200 次循环迭代置换检验，结果如图5B所示。Q2 的回归线与 Y 轴的焦点都在负半轴，表明 PLS-DA 模型稳定可靠，不存在过拟合现象。

差异风味物质筛选

通过 PLS-DA 的变量投影重要度-对牛肉腐败进程中的差异风味物质进行筛选，结果如表 3 所示。

表 3 差异风味物质及其气味描述

以 VIP＞1 为筛选标准，共筛选出16 种差异风味物质，可作为区分牛肉腐败进程的潜在生物标志物，分别为 2-辛酮、正己醛-D、丁醛-M、四氢吡咯-M、异戊醇-D、正丙醇-D、2-甲基四氢呋喃-3-酮、丁醛-D、正戊醇-M、异戊醇-M、2,2,4,6,6-五甲基庚烷-D、正戊醇-D、2,4,5-三甲基噻唑、正己醛-M、正己醇-M 和 2,3-丁二酮。随着保藏时间的延长，正己醛-D、正己醛-M、丁醛-M、丁醛-D、四氢吡咯-M、异戊醇-D、异戊醇-M、正丙醇-D、2,3-丁二酮等刺激性、不愉快风味物质的含量逐渐增加。其中 2,3-丁二酮、丁醛、正己醛等物质阈值较低，对腐败牛肉刺激性气味的形成有重要作用。

本研究对牛肉腐败进程中挥发性化合物进行了测定分析。利用 GC-IMS 建立了4种腐败牛肉的挥发性风味指纹图谱，共提取了67个物质峰，鉴定出55种挥发性化合物。

GC-IMS分析结果表明，牛肉腐败进程的风味存在显著差异，在腐败过程中，牛肉挥发性风味的含量显著增加，其中醇类、醛类、酯类、酸类、呋喃、吡咯、噻唑、胺类、吡嗪和醚类物质在腐败过程中持续增加，酮类烃类和含硫化合物在腐败过程中逐渐增加，在第 7 天时达到峰值，而后逐渐下降。PCA 和 PLS-DA 分析表明不同腐败牛肉样品风味存在显著差异。通过 VIP 值共筛选出16种差异性风味物质，其中正己醛-D、正己醛-M、丁醛-M、丁醛-D、四氢吡咯-M、异戊醇-D、异戊醇-M、正丙醇-D、2,3-丁二酮等刺激性、不愉快风味物质的含量逐渐增加。可作为区分牛肉腐败进程的潜在生物标志物。

本研究建立了牛肉腐败进程挥发性风味的可视化指纹图谱，阐明了牛肉腐败过程中挥发性风味的变化规律，为牛肉腐败进程的精准监测提供一定的理论依据。