白藜芦醇褪黑素对绵羊细胞及卵母细胞的作用

一、引言

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 绵羊卵巢采集自当地屠宰场，离体 2 小时内送达实验室，于预冷生理盐水中保存，用于卵母细胞采集。

2. 细胞系选用绵羊成纤维细胞，由实验室前期分离培养并冻存，复苏后传代至对数生长期用于实验。

3. 白藜芦醇、褪黑素标准品购自知名药企，纯度超 98%，以二甲基亚砜（DMSO）配制成母液，工作液现用现配，确保 DMSO 终浓度低于 0.1%，排除其干扰。

（二）实验分组

1. 细胞实验分对照组、白藜芦醇低剂量组（1 μmol/L）、白藜芦醇高剂量组（10 μmol/L）、褪黑素低剂量组（100 nmol/L）、褪黑素高剂量组（1 μmol/L）及联合用药组（白藜芦醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每组设 6 个复孔。

2. 卵母细胞实验依相同剂量梯度分组，每组至少 30 枚卵母细胞，重复 3 次，确保样本代表性。

（三）实验流程

1. 细胞处理：将绵羊成纤维细胞接种于 96 孔板，培养 24 小时贴壁后换液，分别加入含不同药物浓度培养基，孵育特定时长（24、48、72 小时），对应时间点检测细胞活性、氧化应激指标等。

2. 卵母细胞操作：采用机械法结合酶解法获取卵丘 - 卵母细胞复合体，经体外成熟培养体系预平衡后，加入药物处理，培养 24 小时观察成熟率，后续行孤雌激活评估早期胚胎发育潜能，记录卵裂、囊胚形成数据。

（四）检测指标

1. 细胞活性以 CCK - 8 法测定，吸光度值间接反映存活细胞数量；细胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 双染流式细胞术分析，精准量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 荧光探针标记，荧光强度与 ROS 呈正相关。

2. 卵母细胞成熟依第一极体排出判定，成熟率 = 排出第一极体卵母细胞数 / 总卵母细胞数 ×100%；胚胎发育潜能观察卵裂期胚胎数量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚数 / 卵裂胚胎数 ×100%。

三、结果

（一）细胞层面

1. 细胞活性：与对照组相较，白藜芦醇及褪黑素各剂量组处理 48 小时后显著提升绵羊成纤维细胞活性（P < 0.05），联合用药组增幅尤为突出，高剂量白藜芦醇单药效果次之，表明二者具协同促增殖潜能。

2. 抗氧化能力：药物处理组 ROS 水平呈剂量依赖性降低，褪黑素高剂量组 72 小时降幅达 45%，白藜芦醇组亦有效抑制氧化应激，联合组 ROS 清除效率超 60%，同时抗氧化酶（SOD、CAT）活性增强，维持细胞氧化还原稳态。

3. 抗凋亡表现：流式结果显示，处理组凋亡细胞比率显著减少，白藜芦醇通过激活 PI3K/Akt 通路抑制线粒体途径凋亡，褪黑素则上调抗凋亡蛋白 Bcl - 2，联合用药近乎消除早期凋亡峰，全方位守护细胞存活。

（二）卵母细胞层面

1. 体外成熟：白藜芦醇与褪黑素显著加速卵母细胞成熟进程，高剂量组成熟率较对照组提升约 18%（P < 0.05），联合用药使成熟时间提前约 2 小时，皮质颗粒分布更均匀，预示受精能力增强。

2. 胚胎发育：经孤雌激活，处理组卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜芦醇促进囊胚形成及内细胞团增殖，联合组囊胚发育至孵化阶段比例明显增加，胚胎质量显著优化，为后续胚胎移植奠基。

四、讨论

五、结论