Native top-down proteomics｜助力乳腺癌内分泌治疗耐药分子机制的发现

世卫组织国际癌症研究机构最新发布的数据显示，2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例。 乳腺癌已经取代肺癌，成为全球第一大癌症。蛋白质通过非共价相互作用组装形成功能复合物，驱动细胞内包括乳腺癌等恶性肿瘤相关的几乎所有关键功能，而蛋白质因差异剪接、序列变异、翻译后修饰（PTMs）或突变产生的多种 proteoform 会影响这些功能复合物的形成、稳定性和活性。传统的自下而上蛋白质组学方法在阐明单个蛋白质产生的 proteoform、表征与蛋白质复合物结合的配体和辅因子以及绘制组合 PTMs 模式方面存在局限。原生质谱（Native MS）和自上而下蛋白质组学（Top-down Proteomics）结合形成的Native Top-down Proteomics（nTDP）虽有结构解析能力，但因复杂生物样本中蛋白质复合物丰度低，蛋白质复合物分离困难，缺乏处理大规模 nTDP 数据集的生物信息学工具的等问题，nTDP目前主要用于纯化的蛋白质复合物的分析中，在复杂生物样中的应用较少。在乳腺癌研究中，生长因子信号传导是内分泌治疗抵抗的主要机制之一，表皮生长因子受体（EGFR）扩增及下游信号成分突变与临床他莫昔芬抵抗相关，但具体机制尚未明确。因此，需要一种有效的方法来研究乳腺癌细胞中蛋白质组装体的特征，以深入理解疾病分子机制和设计有效药物，这为该研究开发并应用 nTDP 策略提供了背景和动力。

雌激素受体 α（ERα）阳性的 MCF-7 乳腺癌细胞（后续称MCF-7细胞）和过表达表皮生长因子受体（EGFR）的 MCF-7 细胞（作为 ER 靶向治疗的耐药模型，后续称MCF-7-EGFR细胞）。

研究者开发的nTDP 工作流程如图1所示，首先利用离线native尺寸排阻色谱（nSEC）将从细胞中提取可溶性蛋白质复合物进行分离；随后通过nano-ESI–FAIMS–MSn（液相：Easy-nLC 1200，气相分离装置：FAIMS，质谱：Orbitrap Fusion Lumos ）对蛋白复合物进行native top-down的表征分析；最后利用ProSight Native软件结合手动校正解析复杂质谱数据。

图1：nTDP 工作流程（点击查看大图）

研究者首先利用三个蛋白复合物：carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa)来验证该 nano-ESI–FAIMS–MSn 系统的重现性和稳健性。结果表明该系统可以稳定的分离、碎裂蛋白复合物，产生能有效阐明蛋白质表征的质谱数据（图2-4）。同时还验证了FAIMS可以在气相水平上对高到70kDa蛋白复合物进行分离。（图5）

随后研究者用nSEC系统对乳腺癌细胞（MCF-7和MCF-7-EGFR）的细胞提取物进行分离，nSEC谱结果表明从MCF-7 和 MCF-7–EGFR （16次重复实验）提取的蛋白复合物均能稳定有效的分离。将分离的蛋白复合物用nano-ESI–FAIMS–MSn 系统进行检测，共测出17 种蛋白质复合物的104 种 complexoforms，包括蛋白质 - 金属复合物、蛋白质 - 蛋白质 - 金属复合物及蛋白质 - 蛋白质复合物。

图6：MCF-7中的蛋白质标品和蛋白质聚集体的nSEC谱图、MCF-7细胞中蛋白质聚集体胶图、MCF-7-EGFR中的蛋白质标品和蛋白质聚集体的nSEC谱图、MCF-7-EGFR细胞中蛋白质聚集体胶图。（点击查看大图）

? TPI  complexoforms：TPI是一种与乳腺癌相关的糖酵解酶，有研究表明TPI可能与药物耐药、肿瘤进展和转移有关。研究者在MCF-7和MCF-7–EGFR细胞中均观察到TPI二聚体结构，分子质量约为53 kDa（nSEC-fraction4）。二聚体 TPI 复合物是由截短和磷酸化的单体蛋白质变体组合形成，单体蛋白质变体上发生两个脱酰胺（N15 和 N71）。研究者还发现了由突变（E104D）TPI单体形成的TPI复合物，并且E104D单体亚基的TPI可以被磷酸化、去酰胺化或乙酰化。

图7： MCF-7细胞提取物中TPI complexoforms复合物的nTDP谱图（点击查看大图）

? MIF complexoforms：MIF是在多种癌症、自身免疫疾病和炎症中具有生物学相关性的多功能细胞因子，研究者发现MIF在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 细胞中均高表达，native MS¹ 谱图提供了MIF complexoforms的详细信息，一共形成了五种 MIF（同源和异源）三聚体结构。通过MSⁿ的谱图解析发现了截短的、未修饰的、亚硝基化和乙酰化的MIF单体蛋白质变体（亚硝基化和乙酰化分别发生在C80和K77上）。

图8： MCF-7细胞提取物中MIF complexoforms复合物的nTDP谱图（点击查看大图）

? SOD1 complexoforms：金属酶SOD1是一种重要的抗氧化剂，对于癌基因驱动的乳腺肿瘤形成以及超氧化物转化为O₂和H₂O₂至关重要。研究者在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 细胞中观察到分子质量约为 32 kDa 的 SOD1 二聚体结构，从MS¹谱图（11 + 电荷状态）和MS²谱图（6 + 电荷状态）中均观察到SOD1蛋白质变体亚基中Cu²⁺ 和 Zn²⁺金属离子的非共价结合，SOD1 蛋白质变体还带有 N 端乙酰化、一对二硫键（C57-C111）和N-端甲硫氨酸的切除。

图9： MCF-7细胞提取物中SOD1 complexoforms复合物的nTDP谱图（点击查看大图）

? NUTF2 complexoforms：NUTF2是一种二聚体蛋白，介导小GTP酶Ran的核内转运。研究者从 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 细胞中共鉴定出8 种不同 PTM 组合的NUTF2 蛋白质变体，且这些单体在26 种不同的complexoforms中分布。从MS¹谱图中发现，与 MCF-7 细胞相比，MCF-7-EGFR 中内源性 NUTF2 二聚体复合物含量显著减少，且具有三个乙酰化的 NUTF2 异二聚体是 MCF-7-EGFR 细胞特有的。

前期nTDP数据结果发现MCF-7-EGFR细胞中NUTF2 二聚体的数量显著比MCF-7细胞中低，研究者利用NUTF2 与两种不同的亲和标签共同沉淀，验证 了EGFR 可诱导核转运因子 2（NUTF2）二聚体解离这一结论。NUTF2 的翻译后修饰（PTM）位点在脊椎动物中具有保守性，NUTF2蛋白复合物的晶体结构表明，K4靠近核孔蛋白结合位点。K55和K63靠近Ran结合位点，其中K55参与Ran与NUTF2之间的水介导接触，因此研究者对K4和K55位点进行了突变。结果表明，MCF-7细胞中NUTF2 的表达抑制乳腺癌细胞生长， K4Q 突变可逆转该抑制，K55R 突变则增强抑制，这表明 PTM 位点（K4、K55）可通过影响核孔结合或 Ran 相互作用调节细胞生长。NUTF2下调了雌激素诱导的增殖基因GREB1，而K4Q突变可在没有4OHT的情况下恢复了这一表型。这表明不同 PTM 位点的 NUTF2 proteoforms 会导致不同的生物学结果。

图12 ：NUTF2 调节ER的信号传导并抑制生长

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为了进一步研究 NUTF2 如何调节 ER 信号传导和对 4OHT 的响应，通过 CUT&RUN 技术分析发现，MCF-7 细胞中 ER 与 NUTF2 的结合位点基本不重叠，但 NUTF2 表达和 4OHT 处理会改变 ER 的结合模式。NUTF2 表达会导致 ER 在 1353 个位点的结合存在差异，且 4OHT 处理后 MCF-7 与 MCF-7^NUTF2 细胞的 ER 结合位点既有重叠也有差异。但在 4OHT 敏感的 NUTF2 位点仅发现 132 个共有 ER 基序半位点（即 '1-AGGTCA'），这表明 NUTF2 通过间接机制调节 ER 染色质占有率和活性。为了更清楚的了解NUTF2 生长抑制的分子机制，研究者完成了 MCF-7 和 MCF-7^NUTF2 细胞的 RNA-seq，基因集富集分析表明在 600 多个差异表达基因中，包括上调 RNA 分解代谢相关基因、NuRD 复合物成分（如 HDAC1）和凋亡基因 ERRFI1、下调线粒体氧化磷酸化相关基因（如 BCL2）和致癌基因（如 RAS 家族基因）。通路富集分析表明，这些基因涉及多种癌症和 EGFR 相关通路，支持 NUTF2 作为 EGFR 信号效应因子的作用。ERα-APEX2 邻近蛋白质组学研究显示，NUTF2 表达会改变 ER 的相互作用组，包括 JunB 标记增加、肿瘤抑制因子 HSPBP1 和 CSDE1 标记减少等。对比 NUTF2:WT 与 NUTF2:K4Q 细胞，发现 ER 相互作用组存在差异（如 CNOT9 标记增加、DNMT3A 标记减少），进一步证实 NUTF2 通过调控 ER 相关蛋白相互作用影响通路。

图13：NUTF2-ER的相互作用

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该研究优化 nTDP workflow，结合离线原生尺寸排阻色谱（nSEC）、纳米电喷雾电离（nano-ESI）、场不对称离子迁移谱（FAIMS）和多级串联质谱（MSn），成功从乳腺癌细胞（MCF-7 及MCF-7 -EGFR ）中鉴定出 17 种蛋白质复合物的 104种 complexoforms，包括 蛋白- 金属复合物、蛋白-蛋白- 金属复合物、蛋白-蛋白复合物等，且能表征≤70 kDa 的内源性蛋白质组装体，克服了传统方法在复杂生物样本中分析低丰度蛋白质复合物的局限。

识别了与癌症相关的关键蛋白质复合物，如磷酸丙糖异构酶（TPI）、巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、超氧化物歧化酶（SOD1）的 complexoforms，明确了其翻译后修饰（PTMs）位点（如 TPI 的脱酰胺、磷酸化，MIF 的亚硝基化、乙酰化，SOD1 的金属结合位点等）及其对复合物结构和功能的影响。核心发现：EGFR 过表达会诱导核转运因子 2（NUTF2）二聚体解离。NUTF2 二聚体作为核孔穿梭蛋白参与 RAN 的核输入，其过表达可抑制乳腺癌细胞生长，而不同 PTM 位点（K4 和 K55）的突变会逆转或加剧这一抑制效应，表明 NUTF2 的 PTMs 通过调节雌激素受体（ER）信号通路影响乳腺癌生长。

NUTF2 通过间接调节 ER 的 DNA 结合和蛋白质相互作用网络影响 ER 信号通路，例如下调雌激素诱导的增殖基因 GREB1，上调凋亡基因 ERRFI1 等，从而抑制乳腺癌细胞生长。EGFR 过表达（内分泌治疗抵抗模型）会减少 NUTF2 二聚体水平，改变其 PTMs 模式，导致 NUTF2 对 ER 信号的调控作用异常，可能是 EGFR 介导的他莫昔芬抵抗的重要机制之一。

该方法为复杂生物样本中内源性蛋白质复合物的大规模分析提供了新范式，能够保留脆弱的非共价相互作用，精准表征 proteoform 的 PTMs、组装模式及配体结合，为癌症生物学、药物靶点发现和结构生物学研究开辟了新途径，尤其为理解乳腺癌治疗抵抗的分子机制提供了关键见解。