做实验就像开盲盒，你永远不知道这一次的qPCR会给你“惊喜”还是“惊吓”。
不管是在新课题的预实验中披荆斩棘，还是在老项目的验证中按部就班，那些不走寻常路的扩增曲线和熔解曲线，总能精准地找上门来。
别急着叹气，也别盲目地重复加样！虽然这些异常曲线看起来千奇百怪，但它们其实都是会说话的“说明书”。只要静下心来，掌握一套系统的分析思路，搞清楚背后的原理，你就能分分钟拿捏它们，顺利拿到完美数据，从此告别无效加班的噩梦！
? 原因分析：
荧光定量仪器参数设置错误，上机前对应荧光信号采集开关(小相机)没有打开。
仪器界面展示处以ABI Q5为例
? 解决方案：
可在问题数据的运行程序中检查，相关采集开关是否正常开启。若未正常开启，则需要重新准备上机反应体系，设置好对应的参数，打开采集开关再次检测。
扩增曲线线性图显示为一条笔直的线或对数图的▲Rn不超过1且在低水平徘徊，则无扩增。
? 原因分析及解决方案：
可能是引物降解带来的影响。当引物储存不当时会导致引物降解并失去特异性，进而降低扩增效率。可通过核酸电泳的方式检测引物的完整性，若原先的特异性条带变成弥散带，则表示引物发生降解。针对引物保存，需考虑以下四个建议：
a、引物冻干粉在长时间储存和储存温度上有着更强的灵活性和保障；
b、引物浓度对稳定性也会产生影响，不建议以低于10μM的浓度储存引物，在大多数情况下，100μM的引物使用更加灵活容易；
c、引物探针也需和RNA一样分装储存，以尽可能减少反复冻融带来的影响；
d、TE缓冲液的储存环境比水更加稳定。
可能是模板浓度太低造成检测困难。建议减少cDNA稀释浓度重复实验即可，通常情况下，未知浓度的样品先从原液开始测。
可能是模板降解。这种情况下，需要重新制备RNA模板或cDNA模板，重新实验。
? 原因分析：
在对数图扩增曲线中，若基线期为连续曲线，则有可能是基线期设置循环周期偏少造成。
? 解决方案：
可以在设置中增大基线的终点值，调整后可恢复正常，如下图所示：
? 原因分析：
在对数图扩增曲线中，若扩增曲线基线期连续且后续出现明显分段现象，则有可能是基线期设置循环周期偏多造成。
? 解决方案：
可以在设置中减小基线的终点值，调整后可恢复正常，如下图所示：
? 原因分析及解决方案：
少数情况下，PCR反应管可能没有盖紧，当仪器进行热循环时，反应液出现挥发、泄露。在上机前，建议用洁净的手套或镊子压紧管盖以避免该风险。
少数情况下，PCR反应液在管中可能出现挂壁，在反应进行时由于重力因素反应液下滑或最终进入反应体系。在上机前，建议使用桌面小离心机对PCR管进行离心，肉眼观察无反应液挂壁，上机过程小心为上，减少抖动和碰撞发生。
多数情况下，可能是体系中抑制物较多，导致荧光不稳定。当RNA提取样本充裕的情况下，建议重新提取高纯度RNA进行反转录、荧光定量。当RNA提取样本缺失或稀少的情况下，建议稀释cDNA后重新上机，减少抑制物的抑制作用。
多数情况下，可能是仪器开机后长时间运行，使用过度，导致荧光收集不稳定。建议让仪器待机/关机一段时间后，重新开启运行。
? 原因分析及解决方案：
平台期对Ct值影响不大。计算Ct值时，是通过阈值线(上图绿色水平线)与扩增曲线指数期的交叉点进行的，故平台期对于Ct值的影响不大。
无法到达平台期可能是因为循环数设置太少，增加循环数可有助于观察到明显的平台期。
当试剂扩增效率比较低时，酶活力不持久，下降较快，平台期也可能会出现不明显的现象。可通过增加镁离子浓度或更换效力更强的酶解决该问题。
? 原因分析及解决方案：
可能是基线选取的范围不正确，其中的基线终点大于曲线对应的Ct值。当模板DNA投入过多时(投入高浓度cDNA原液或cDNA上样比例＞20%)，基线范围仍取为3-15，其中会包含部分扩增信号，从而导致阈值线过高，对应的平台期在计算时会出现下滑现象。这种情况下，可减少基线期终点，重新分析数据。
? 原因分析及解决方案：
若目的基因在样品中的丰度较低，则可能出现Ct值偏大的现象。该情况下可选择增加反转录时RNA的投入量或者减少cDNA的稀释倍数可调整对应的Ct值。当RNA投入量是原先的2倍时，Ct值对应可减少1(21=2);当cDNA稀释倍数由8倍调整为2倍时，Ct值对应可减少2(22=4)。
设计的目的片段过长，仅部分目的片段在每个循环中扩增，从而导致Ct值偏大。建议将目的扩增片段长度设计为80-200bp之内，不建议超过300bp。
体系中可能存在抑制剂，导致扩增效率下降，最终使得Ct值偏大。建议减少投入的模板量或重新制备纯度更高的RNA。
? 原因分析及解决方案：
可能是加样误差大导致的重复性差。仪器方面，需要每年对移液枪进行一次校正。在操作方面，采取先加大体积后加小体积液体的方式。移液器使用时采取二档吸液一档出液的方式，若下一次移液不更换枪头，则第二枪开始一档吸液一档出液。
试剂或预混体系没有彻底混匀，也会导致重复性偏差。建议在分装反应液前，先将反应液以震荡或吹打的形式进行充分混匀。上机之前，将PCR管离心，使得所有的液体都在反应管底部。
仪器未使用ROX校正，则也可能发生重复性偏差的现象。最好选用ROX校正。当所用试剂不含ROX时或ROX添加浓度不合适时，将ROX校正关闭。
当基因本身丰度低或模板浓度低时，Ct值会在30以上，同时Ct值重复性差。该情况下，建议将复孔数增加至4-6个，从中适当舍弃1-2个偏差较大的数据。
还有一种是边缘效应，即边缘孔与中心孔的扩增效率不一致，导致荧光信号采集偏差，影响定量结果的准确性。后续实验中建议标准品和样本尽量放在中心孔，边缘孔加无模板对照（NTC）或不加入反应体系。
? 原因分析及解决方案：
可能是ROX浓度与机型不能匹配造成这种现象。建议在设置中找到Passive Reference后将ROX改为None，重新分析即可获取正常的扩增曲线，如下图所示。
? 原因分析及解决方案：
可能存在大小相近的非特异扩增，可以通过两种方法进行判断，简单的方式是观察起峰到落峰的温度跨度，若跨度不大于7℃，则可视为单峰。另外相对复杂的方法是将产物进行高浓度琼脂糖电泳(如3%琼脂糖)进行辅助判断。
? 原因分析及解决方案：
引物二聚体在引物对之间存在部分序列同源性时会形成，其长度通常会低于80bp，在70℃范围区间会形成低荧光且更宽的波峰。具体的波峰大小会根据引物二聚体的大小和GC含量而发生变化。进行荧光定量之前，检查引物二聚体的方法有多种，最好的可视化方法是进行核酸电泳，形成的引物二聚体通常会在凝胶底部附近显示为弥散带。减少引物二聚体的方法如下：
优化热循环条件，主要是提高退火温度；
降低引物浓度。在多数情况下，引物终浓度为200 nM，可选择降低至60 nM；
第一次针对一个靶标设计引物时，可尝试设计三对引物组，选用其中效率最高、特异性表现最好的引物进行实验。
? 原因分析及解决方案：
可能是cDNA样本中存在gDNA污染，引物设计时未跨内含子造成的其他扩增产物。建议设计引物时跨内含子且不在单一外显子模块中设计，或在RNA提取时，选用带gDNA去除的RNA提取试剂盒，或是在反转录获取cDNA时，选用带gDNA去除的反转录试剂。
可能是引物特异性过差导致的非特异扩增。建议将引物序列输入至NCBI中进行特异性分析，检测在同物种中是否存在其他配对序列。
NTC：又称为无模板对照，指除DNA或cDNA样品以外的所有反应组分。在这些对照中检测到的扩增通常是由于引物二聚体或扩增的PCR产物污染造成。这两类污染会导致相关靶标的表达水平被人为的升高。
NTC对应Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃
? 原因分析及解决方案：
引物二聚体导致的非特异扩增，具体解决方案可见上述【熔解曲线为双峰且较低峰Tm在80℃之前】。其中值得注意的点是，若实验组和阴性对照组之间的Ct值差值远大于10，则表示引物二聚体对于靶标片段扩增的影响不大，数据可用于分析。
NTC对应Ct值＜35，NTC熔解曲线与基因熔解曲线峰形重叠。
? 原因分析及解决方案：
这种情况下，多是由于体系中出现污染，例如水中、引物中、试剂中出现对应的模板，多为枪头未更换带来的交叉污染。该情况下，需要以控制变量的方式逐步排查污染源。
? 原因分析及解决方案：
可能是反应体系中出现污染，建议结合阴性对照结果确认污染情况，从水、引物、酶和环境等注意排除污染。
可能是荧光定量试剂暴露在强光或者高温下导致试剂失效进而导致该问题出现，建议用新的荧光定量试剂进行对比试验。
耗材与仪器不匹配，不能满足荧光定量仪器光源对于耗材的需求。这种情况下，需确认仪器所对应的耗材要求，选择正确且质量有保证的耗材进行重复试验。
仪器长时间未校正也可能会引发该情况。仪器方面建议每一年校正，以保证数据的稳定性。
? 原因分析及解决方案：
可能是ROX浓度与机型不能匹配造成这种现象。建议在设置中找到Passive Reference后将ROX改为None，重新分析即可获取正常的熔解曲线，如下图所示。
高灵敏显色示踪荧光定量预混液
Hieff UNICON? ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix(No/Low/High ROX)
移液追踪：降低漏加/错加风险
扩增优异：在宽广的线性范围内有良好的线性关系
精准度好：可精准区分2倍浓度差异模板
重复性好：复孔孔间差异小，有更好的重复性
稳定可靠：反应体系可于常温放置24小时，产品反复冻融20次不影响
产品定位 | 产品名称 | 产品货号 | 产品规格 |
高灵敏显色示踪荧光定量预混液 | Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11188ES08 | 5×1 mL |
Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11189ES08 | 5×1 mL | |
Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11190ES08 | 5×1 mL |
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产品定位 | 产品名称 | 产品货号 | 产品规格 |
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5分钟一步完成gDNA去除与反转录 | Hifair AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR | 11151ES60 | 100 T |
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高效反转预混液（含gDNA去除)，高质量cDNA的不二之选！ | Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
高灵敏显色示踪荧光定量预混液(染料法) | Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox) | 11188/89/90ES08 | 5×1 mL |
高灵敏通用型定量预混液（染料法） | Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 mL |
高特异高荧光值定量预混液（染料法) | Hieff UNICON Advanced qPCR SYBR Master Mix | 11185ES08 | 5×1 mL |
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翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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