抗体ZL和高通量筛选中的单细胞包覆的液滴微流控实验

液滴微流控和单细胞包覆为抗体ZL中的发现提供了关键。本文着重于充分挖掘天然B细胞多样性以快速从人类患者中分离抗原特异性抗体的应用。人抗体库确实越来越被认为是ZL级抗体的有价值来源。然而，用于开发表达反抗体表达的B细胞的方法在其快速分离稀有和抗原特异性结合物的能力方面受到限制。如下ZD介绍了将200万个初级B细胞封装到皮升大小液滴的微流体技术，其中同源V基因在液滴内融合形成scF-v盒文库。

使用液滴微流控进行单细胞包覆

实验方法
该方法包括将单个B细胞包裹到体积为400μL的油包水液滴里面。玻璃芯片的入口有2个，允许2种液滴试剂通入到芯片的通道内。

OB1压力控制器用来产生高速率且稳定可靠的尺寸均匀的液滴。将细胞水溶液和RT-PCR混合物各自在30mbar下泵送，同时将HFE7500氟化油+2%w/v008-氟表面活性剂在67mbar下泵送，通过调节OB1压力控制器的输出压力以获得1:1的水性混合物流体。

这样做，可以在40分钟内常规封装100万个B细胞。微流体芯片的结构设计用于合并两种含水流体流：一种携带B细胞悬浮液，另一种含有RT-PCR混合物。将所得乳液收集在PCR条带管中并用40μL的矿物油覆盖。除去过量的氟化油，以保持总体积约为100μL。

实验装置
用到的仪器
Elveflow压力和流量控制器（OB1 MK3）

样品储液池（小型、中型和大型），每个培养基样品对应一个样品储液池。

玻璃芯片

实验结果
从康复期供体中纯化分离的B细胞，并用RT-PCR试剂包封入油包水液滴中，使得同源VH和VL结构域被扩增和连接。得到的RT-PCR扩增子形成表达准备的scFv，其可以直接表达用于筛选，在噬菌体上展示用于选择，并且用于谱系表征的深度测序。

在40分钟内可以常规封装100万个B细胞。滴定B细胞悬浮液以使每10个液滴达到~1个细胞，基于泊松统计，将导致单细胞包覆的概率>95%。

在此，包覆液滴的细胞收集到μ-Slide通道载玻片（Ibidi）中并以200×放大率成像。将细胞用CellTracker Red和Green染料染色，混合，并以有利于单细胞包覆的密度包覆到液滴里面。每个液滴形成一个独立的反应器，其中细胞的同源V基因可以被扩增和配对。

结论
用于单细胞包覆的液滴微流控允许从数百万初级B细胞快速捕获天然库，因此能够实现功能强大且灵敏的筛选平台，对ZL性抗体开发、免疫谱表征具有重要意义，并且可在合理的疫苗设计中具有广泛的应用。

这里概述的过程是从自然库中发现抗体Z快的过程之一。一名研究人员可在4周内从数百万初级B细胞迅速发展为特异性单克隆抗体。

这一过程可能是对抗新出现的传染定的宝贵工具，例如Z近爆发的埃博拉病毒和寨卡病毒。

（1）<1% CV单分散性
        确保wan美控制的液滴尺寸

（2）较低的试剂成本和分析时间
        40ms建立时间：在启动系统时，短的建立时间可以降低昂对样品的损失。

（3）高通量包覆
       筛选适用于数据收集的大范围的理想数据集合的变量

（4）工作流程自动化
      创建自己的控制序列并让其自动流动